Effects of Giant Salamander Protein Peptide and Its Maillard Reaction Product on Blood Glucose, Lipid Levels, Immune Function,and Anti-fatigue Activity in Vivo
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摘要: 目的：探究大鲵蛋白肽（CGS）及其美拉德反应产物（CGSXyU）对Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖血脂、免疫低下小鼠免疫调节功能及正常小鼠抗疲劳功能活性的影响。方法：将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（200 mg/kg盐酸二甲酸胍）、低剂量样品组（CGS/CGSXyU-L，50 mg/kg）和高剂量样品组（CGS/CGSXyU-H，200 mg/kg），使用100 mg/kg四氧嘧啶建模成功后，灌胃3周，测定小鼠空腹血糖浓度、血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平；将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（50 mg/kg左旋咪唑）、低剂量样品组（CGS/CGSXyU-L, 50 mg/kg）和高剂量样品组（CGS/CGSXyU-H, 200 mg/kg），使用100 mg/kg环磷酰胺建模成功后，灌胃3周，记录小鼠体重并测定免疫低下小鼠脏器指数变化以及细胞因子含量变化；将小鼠随机分为空白对照、阳性对照组（200 mg/kg牛磺酸）、低剂量样品组（CGS/CGSXyU-L，50 mg/kg）和高剂量样品组（CGS/CGSXyU-H, 200 mg/kg），灌胃4周，测定小鼠负重游泳时间、尿素氮及肌酸激酶、血清乳酸含量及抗氧化酶活性。结果：CGS/CGSXyU-L/H 处理组小鼠空腹血糖浓度、血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均有不同程度的降低，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平提高；CGSXyU-H可以显著（P<0.05）促进免疫低下小鼠体重、脏器指数升高以及免疫细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）含量升高；CGS/CGSXyU-L/H 处理组负重游泳时间升高，肌酸激酶活性、血清乳酸含量降低，CGS-H以及CGSXyU-L/H 处理组尿素氮含量下降，CGSXyU-H处理组GSH-Px活性显著上升（P<0.05），CGS-H以及CGSXyU-L/H 处理组SOD活性上升。结论：大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物可调节Ⅱ型糖尿病小鼠血糖及血脂代谢，增强免疫低下小鼠免疫功能并有效提升正常小鼠的抗疲劳能力。Abstract: Objective: To investigate the impact of giant salamander protein peptide (CGS) and its Maillard reaction product (CGSXyU) on lowering blood glucose and lipid levels in type Ⅱ diabetic mice and enhancing immunomodulatory functions in immunosuppressed mice, and anti-fatigue effects in normal mice. Methods: Mice were randomly assigned to a blank control group, a model control group, a positive control group (200 mg/kg metformin), a low-dose sample group (CGS/CGSXyU-L, 50 mg/kg), and a high-dose sample group (CGS/CGSXyU-H, 200 mg/kg). Following the successful induction of diabetes with 100 mg/kg alloxan, the mice underwent gavage treatment for 3 weeks, after which their fasting blood glucose levels, serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels were measured. Mice were randomly assigned to a blank control group, a model control group, a positive control group (50 mg/kg levamisole), a low-dose sample group (CGS/CGSXyU-L, 50 mg/kg), and a high-dose sample group (CGS/CGSXyU-H, 200 mg/kg). Following successful modeling with 100 mg/kg cyclophosphamide, the mice underwent gavage for three weeks, during which their body weights were recorded, and changes in organ indices and cytokine levels were assessed. Similarly, mice were randomly divided into a blank control group, a positive control group (200 mg/kg taurine), a low-dose sample group (CGS/CGSXyU-L, 50 mg/kg), and a high-dose sample group (CGS/CGSXyU-H, 200 mg/kg). They were subjected to gavage for four weeks, after which the mice's weight-bearing swimming time, urea nitrogen levels, creatine kinase activity, serum lactate levels, and antioxidant enzyme activity were measured. Results: The CGS/CGSXyU-L/H treated group of mice exhibited reduced fasting blood glucose concentration, serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), along with elevated high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels. CGSXyU-H significantly enhanced the body weight (P<0.05), organ index, and levels of immune cytokines (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ) in immunocompromised mice. The CGS/CGSXyU-L/H treatment group demonstrated increased time in weight-bearing swimming, reduced creatine kinase activity and serum lactate levels, the BUN level in the CGS-H and CGSXyU-L/H groups decreased, while the GSH-Px activity significantly increased in the CGSXyU-H group (P<0.05), the SOD activity in the CGS-H and CGSXyU-L/H groups also increased. Conclusion: The protein peptides from Andrias davidianus and their Maillard reaction products regulate blood glucose and lipid metabolism in type Ⅱ diabetes mice, bolster immune function in immunocompromised mice, and effectively improve the anti-fatigue capacity in normal mice.
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大鲵，又名娃娃鱼，是迄今为止发现最大的两栖动物属。因其极高的营养价值和药用价值，被誉为“水中人参”[1]。大鲵作为一种高蛋白低脂肪的两栖动物，肉质鲜美、营养丰富，富含多种活性物质[2]，具有益智、滋补、养血、补气等功效，能有效地预防心脑血管疾病、恶性贫血和癌症疾病[3]。目前，人工养殖大鲵主要以新鲜销售为主，加工利用水平相对较低[4]。近年来，为了提高大鲵的经济附加值，大鲵肉常被加工成蛋白酶解物及多肽等[5]。与蛋白质相比，多肽不仅吸收率高同时具有显著的生物功能活性，如抗氧化、抗炎和抗菌等[6]。周艳华等[7]制备了大鲵皮胶原肽并发现分离纯化后的肽具有较高的抗氧化活性；刘俊霞等[8]通过响应面法优化大鲵肽-硒螯合物制备工艺并发现其具有较强的羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及还原能力；赵世博等[9]发现大鲵肽-硒螯合物对D-半乳糖致小鼠氧化应激损伤具有一定的保护作用。此外，大鲵骨肽对高尿酸血症小鼠有明显的降尿酸作用[10]，大鲵肽联合有氧运动可以有效缓解高脂饮食诱导的肥胖[11]。然而，大鲵蛋白酶解过程中产生的疏水性氨基酸（如异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等）会导致蛋白肽呈现苦味，这限制了其在食品工业中的商业应用[12]。
美拉德反应是还原糖的羰基与氨基酸、肽或蛋白质的氨基之间复杂的非酶褐变反应[12−13]，它可以有效改善水产制品的色泽和风味，在水产制品的生产中已得到广泛应用[14]。刘美娇等[15]研究发现，酶解及美拉德反应后可以提升金鲳鱼加工副产物酶解液的整体鲜味、甜味和风味；刘瑞等[16]发现美拉德反应有效改善了双斑东方鲀酶解液的风味；刘茜[17]通过对带鱼多肽美拉德反应前后性质研究和结构表征分析，发现美拉德反应显著影响了带鱼多肽的物理化学性质和结构从而提升其抗氧化活性。目前大多研究主要集中在蛋白肽体内外抗氧化活性功能及美拉德反应对蛋白肽风味结构和抗氧化功能的影响，关于蛋白肽及其美拉德反应产物对动物体内血糖血脂、免疫功能及抗疲劳功能活性影响的关注点较少。
因此，本文以大鲵蛋白肽为原料，研究大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖血脂、免疫低下小鼠免疫调节及正常小鼠抗疲劳能力的影响，研究结果对提高大鲵附加值具有重要意义，同时为进一步开发大鲵蛋白肽功能性食品提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
人工养殖大鲵 购自浙江山鼎生物科技有限公司，大鲵屠宰方法符合GB 12694-2016《畜禽屠宰加工卫生规范》，储存在−80 ℃超低温冷冻柜中；SPF级别雄性Balb/c小鼠70只、雄性ICR小鼠142只（6~8周龄，体重18~20 g） 购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司（生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009），实验得到了浙江工商大学实验动物伦理委员会的批准（许可证号：SYXK（浙）2020-0027），所有小鼠饲养在恒定温度（23±2） ℃，恒定湿度50%±5%，12 h光照/黑暗循环的环境中；氯化胆碱（AR，99%）、盐酸左旋咪唑（BR，99%）、环磷酰胺（BR，98%）、四氧嘧啶（AR，98%）、木瓜蛋白酶（食品级，1000000 U/g）、D-木糖（AR，98%） 中国北京宝西迪科技有限公司；全血乳酸测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒、ELISA试剂盒 赛默飞世尔科技有限公司；清洁级动物饲料、动物垫料 中科生命科技有限公司。
GA-3安稳血糖测定仪 三诺生物传感股份有限公司；Neofuge23R台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机有限公司；BS-240vet全自动生化分析仪 迈瑞医疗国际有限公司；Pi Lot3-6E真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；AMR-100全自动酶标仪 苏州阿尔法生物实验器材有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵蛋白肽的制备
大鲵蛋白肽的制备参考Li等[4]的方法并稍作修改。将冷冻大鲵置于4 ℃流水解冻，去除头部、尾部、表皮和内脏，在4 ℃下匀浆装入自封袋，真空冷冻干燥后制成大鲵冻干粉，储存于−20 ℃冰箱中备用。将大鲵冻干粉按1:100 的比例（w/v）溶解于pH7的蒸馏水中，并在溶液中添加木瓜蛋白酶（1:0.06，大鲵冻干粉:木瓜蛋白酶，w/w），将溶液水浴超声预处理1 h（55 ℃，360 W）后置于恒温水浴（55 ℃）中酶解4 h，并在95 ℃下灭酶15 min，最后12000 r/min离心10 min，上清液经过1 μm滤纸板框过滤后冷冻干燥（0.001 MPa，−40 ℃）即得大鲵蛋白肽粉末。
1.2.2 木糖低共熔溶剂（Natural deep eutectic solvents，NADES）及大鲵蛋白肽美拉德反应产物的制备
参照Fu等[12]的方法并稍做修改，具体方法如下，将氯化胆碱与D-木糖以1:1的摩尔质量比充分混合，于水浴锅中静置5 h（85 ℃），待混合物转化为透明液体即为木糖NADES，将其置于4 ℃冰箱中保存以供进一步使用。
大鲵蛋白肽粉末（0.15 g）溶解在3 mL蒸馏水中，并与木糖NADES（15 g）混合均匀，置于超声水浴（80 ℃，960 W）中1 h 20 min，采用300 Da透析袋透析36 h后将所得产物冷冻干燥并储存在−80 ℃冰箱中备用，即为大鲵蛋白肽美拉德反应产物。
1.2.3 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物降血糖、降血脂功能活性小鼠实验
1.2.3.1 小鼠分组及处理
选取体重（18~20） g的SPF级雄性ICR小鼠70只，随机分为7组，适应性饲养1 周，然后全部禁食不禁水24 h，测定各组小鼠初始血糖后，空白组腹腔注射生理盐水，其余6组小腹腔注射四氧嘧啶溶液（ALX，100 mg/kg mb），每隔1 d注射一次，共注射4次，正常饲喂3 d后，禁食不禁水12 h后用血糖仪进行尾部采血统计血糖浓度，以空腹血糖浓度不低于11.1 mmol/L为Ⅱ型糖尿病模型成功标准。
给药剂量参照文诗雨等[18]方法，建模成功后分组及灌胃给药情况如下：大鲵蛋白肽高剂量给药组（CGS-H，200 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽低剂量给药组（CGS-L，50 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物高剂量给药组（CGSXyU-H，200 mg/kg mb ）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物低剂量给药组（CGSXyU-L，50 mg/kg mb）、模型对照组（M，等量生理盐水）、阳性对照组（PC，200 mg/kg mb盐酸二甲双胍溶液）、空白对照组（C，等量生理盐水）。每日早上8:30定时给药，灌胃时以0.1 mL/10 g mb为标准进行灌胃，每天一次，连续灌胃给药3周。
1.2.3.2 小鼠空腹血糖浓度测定
分别于给药第1、2、3周，各组小鼠禁食不禁水12 h后尾部取血，用血糖仪测定血糖浓度。
1.2.3.3 小鼠血脂指标检测
实验结束后采用摘除眼球法取小鼠血清，采用ELISA试剂盒检测血清总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（Highdensity liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density liptein cholesterol，LDL-C）水平。
1.2.4 大鲵蛋白肽免疫调节功能小鼠实验
1.2.4.1 小鼠分组及处理
小鼠分组参照刘迪迪等[19]并稍作修改，选取体重（18~20） g的SPF级雄性Balb/c小鼠70只，随机分为7组。小鼠分组之后，小鼠适应性喂养7 d，给予小鼠正常的饲料和水。从第8 d开始，对除空白组外的所有小鼠注射环磷酰胺（CTX，100 mg/kg mb），连续5 d。若小鼠与空白组小鼠相比精神萎靡、体重下降明显，说明免疫低下模型造模成功。
建模成功后分组及灌胃给药情况如下：大鲵蛋白肽高剂量给药组（CGS-H）（200 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽低剂量给药组（CGS-L）（50 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物高剂量给药组（CGSXyU-H）（200 mg/kg mb ）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物低剂量给药组（CGSXyU-L）（50 mg/kg mb）、模型对照组（M）（等量生理盐水）、阳性对照组（PC）（50 mg/kg mb左旋咪唑溶液）、空白对照组（C）（等量生理盐水）。每日早上8:30定时给药，灌胃时以0.1 mL/10 g mb为标准进行灌胃，每天一次，连续灌胃给药3周。
1.2.4.2 小鼠免疫脏器指数的测定
免疫脏器指数的测定参照Ademiluyi等[20]的方法并稍作修改。适应性喂养7 d后，对小鼠称重，记为初始体重，动物处死前再次称重，供免疫脏器指数计算时使用。将灌胃21 d后的小鼠，于停药次日称重处死，解剖取小鼠胸腺和脾脏组织，在生理盐水中清洗去除杂质，滤纸吸干表面水分，称重并记录数据，按下式计算脏器指数：
胸腺指数(%)=胸腺重量(g)小鼠体重(g)×100 脾脏指数(%)=脾脏重量(g)小鼠体重(g)×100 1.2.4.3 ELISA测定细胞因子含量
细胞因子含量检测参照左婕等[21]、李金等[22]并稍作修改，具体方法如下：对小鼠眼眶静脉丛取全血，于室温下静置2~3 h后，离心（25 ℃，3000 r/min，10 min），取上清液得到血清。ELISA法检测各组小鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 分泌量水平，具体操作根据试剂盒说明书进行。采用全波长酶标仪检测A450值，计算血清中四种免疫因子的含量。
1.2.5 大鲵蛋白肽抗疲劳功能小鼠实验
1.2.5.1 小鼠分组及处理
选取体重（18~20） g SPF级雄性ICR小鼠72只，随机分为6组，小鼠分组之后，小鼠适应性喂养7 d，给予小鼠正常的饲料和水。
给药方式如下：大鲵蛋白肽高剂量给药组（CGS-H）（200 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽低剂量给药组（CGS-L）（50 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物高剂量给药组（CGSXyU-H）（200 mg/kg mb）、大鲵蛋白肽美拉德反应产物低剂量给药组（CGSXyU-L）（50 mg/kg mb）、阳性对照组（PC）（200 mg/kg mb牛磺酸溶液）、空白对照组（C）（等量生理盐水），持续给药4周。
1.2.5.2 小鼠负重游泳实验
负重游泳实验方法参照岑燕霞等[23]并稍做修改，于末次给药各组小鼠之后30 min，随机选取6只小鼠，将小鼠放入水中游泳（水深30 cm，水温 25±0.5 ℃），在小鼠游泳期间，为了保证小鼠不停游动，需搅动池中的水。在鼠尾根部负荷5%体重的铅块，记录小鼠自游泳开始至力竭的时间，该时间即为负重游泳力竭时间。
1.2.5.3 生化指标测定
分组及给药方法同上，测定方法参照白海军[24]并稍作修改。末次给药后30 min，将小鼠放入水中游泳（水深30 cm，水温 25±0.5 ℃），90 min取出，15 min后目内眦静脉采血，离心（4 ℃，3000 r/min，10min）。取血清采用全自动生化分析仪检测其尿素氮（BUN）的含量和肌酸激酶（CK）的酶活力。取血清采用试剂盒检测其乳酸（LD）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。
1.3 数据处理
采用SPSS和Origin对数据统计分析。对于差异显著性分析，数据采用单因素方差分析，P<0.05时认为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血糖、血脂的影响
2.1.1 小鼠血糖浓度变化分析
空腹血糖是诊断Ⅱ型糖尿病的常规指标，其与血清胰岛素等指标相结合能够体现机体对血糖的调节能力[19]。每周固定时间测定小鼠空腹血糖，CGS及CGSXyU对小鼠血糖的调节情况如表1所示。
表 1 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血糖影响Table 1. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on blood glucose levels in mice组别 血糖浓度（mmol/L） 初始 建模1周 给药1周 给药2周 给药3周 C 5.20±0.20Aa 5.50±0.65Ba 4.97±0.47Ca 5.17±0.21Da 5.30±0.46Ea M 5.10±0.26ABb 23.70±3.40Aa 24.10±4.90Aa 24.50±3.16Aa 24.37±2.08Aa PC 4.80±0.30ABe 23.30±0.10Aa 19.63±1.46Bb 16.73±0.93Cc 14.37±0.42Dd CGS-L 4.37±0.21Bd 23.80±2.61Aa 22.77±0.15ABa 20.57±0.25Bb 17.90±0.20Bc CGS-H 4.97±0.058ABe 24.00±1.31Aa 21.33±0.15ABb 18.57±0.25BCc 15.63±0.31CDd CGSXyU-L 4.8±0.61ABd 23.67±1.62Aa 22.43±0.21ABa 19.53±0.15Bb 16.53±0.35BCc CGSXyU-H 5.4±0.85ABe 23.73±0.74Aa 20.5±0.30ABb 17.07±0.15Cc 14.8±0.17Dd 注：C，空白对照组；M，模型对照组；PC，阳性对照组；不同大写字母表示同一时间不同组别之间的显著性差异，P<0.05；不同小写字母表示同一组别不同时间之间小鼠空腹血糖的显著性差异，P<0.05。 如表1所示，造模1周后，模型组小鼠空腹血糖显著高于11.1 mmol/L （P<0.05），证明本实验糖尿病小鼠的建模成功。模型组小鼠空腹血糖整体表现出高水平状态，建模1周后血糖浓度高达 23.70±3.4 mmol/L且3周后无明显变化；阳性对照组及样品高剂量组的糖尿病小鼠在灌胃1周后空腹血糖显著下降（P<0.05），并且直至第3周一直呈现下降趋势，说明GGS及CGSXyU均能够降低小鼠的血糖；这一结果与Sasaoka等[25]研究结果一致，其表明由贝斯特鲟副产物制备的胶原蛋白肽对升高的血糖水平具有抑制作用。在给药第3周，与CGS组相比，CGSXyU组干预的小鼠，空腹血糖的含量降低，说明美拉德反应可以提升CGS的降血糖功效。这同Ademiluyi等[20]研究发现一致，与酪氨酸相比，酪氨酸美拉德反应产生的抗氧化产物对调控餐后高血糖具有更明显的功效。
2.1.2 小鼠血脂浓度变化分析
糖尿病的发展过程中经常伴有血脂代谢紊乱的情况[20−21]，其与高血脂之间有着极强的相关性。糖脂代谢紊乱时更容易引起心脑血管疾病的发生进而诱发糖尿病患者死亡[22]。患有Ⅱ型糖尿病时，常见的血清检查指标里，总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）会出现高于正常值的情况，而高密度脂蛋白（HDL-C）含量则会低于正常值[23]。CGS及CGSXyU对Ⅱ型糖尿病小鼠血脂相关指标的影响如图1所示。
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由图1可知，与空白对照组相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C含量均显著升高（P<0.05），HDL-C显著降低（P<0.05），说明糖尿病造模小鼠出现了严重的血脂代谢异常。与模型组相比，经阳性对照及样品干预灌胃后小鼠血清TC、TG、LDL-C含量均有不同程度的降低（P<0.05），HDL-C含量显著提高（P<0.05），说明盐酸二甲酸胍和CGS/CGSXyU均能够调节糖尿病小鼠的异常血脂。这个结果与李金等[22]研究结果一致，其表明牦牛胶原蛋白肽可以显著降低模型组小鼠血清中 TC、TG、LDL-C含量，提升HDL-C含量。此外，高密度脂蛋白常被称作“好胆固醇”，它具有移除胆固醇的“能力”，极大程度上可规避心机梗塞、动脉粥样硬化的风险[26]。与CGS-/CGSXyU-L组相比，CGS-/CGSXyU-H组中小鼠的HDL-C含量更高，TC和TG含量更低（P<0.05），这同Ye等[27]的研究结果一致，高剂量猴鱼肽在调节血脂水平方面最有效。
2.2 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠免疫调节功能的影响
2.2.1 小鼠体重变化分析
小鼠体重变化情况见表2。与空白组相比，CTX处理的小鼠体重均呈现不同程度的下降，说明免疫低下小鼠模型造模成功[28]。造模后的小鼠毛发黯淡稀疏、体型瘦小、精神萎靡且反应力迟钝，进一步说明了模型成功。连续灌胃3周后，小鼠反应力提升、摄食量增大且毛发较于造模期间光亮柔顺。小鼠体重较造模期间的体重均有所上升（P<0.05），但不同剂量组小鼠体重上升高于模型组（P<0.05），说明CGS和CGSXyU对CTX所致的体重下降具有一定的恢复作用，可以改善CTX导致免疫能力低下引起的体重下降。
表 2 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠体重影响Table 2. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on body weight of mice组别 初始体重（g） 造模体重（g） 最终体重（g） C 23.53±1.05b 24.96±1.13ab 25.60±0.74a M 23.07±0.26a 17.79±0.57c 19.06±0.74b PC 23.52±1.28a 18.33±0.45c 20.69±0.78b CGS-L 22.69±1.12a 18.36±1.47b 20.77±0.15a CGS-H 22.10±0.91a 17.61±1.20b 20.33±0.38a CGSXyU-L 22.40±0.43a 19.01±1.08b 21.43±0.77a CGSXyU-H 21.62±1.52a 18.68±0.45b 23.99±1.78a 注：C，空白对照组；M，模型对照组；PC，阳性对照组；不同小写字母表示同一组别不同时间之间小鼠体重的显著性差异，P<0.05。 2.2.2 小鼠免疫脏器指数变化分析
脾脏和胸腺是机体最主要的免疫器官，机体的免疫活性与其脏器指数密切相关[29]。其中脾脏指数可反映体液免疫功能，胸腺指数代表细胞免疫功能。CGS/CGSXyU对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响，如图2所示。
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图 2 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠免疫脏器指数影响Figure 2. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the immune organ index of mice与对照组相比，模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著降低（P<0.05），表明CTX诱导的免疫抑制模型建立成功。前期研究表明，CTX能够抑制小鼠免疫器官的发育并诱发免疫器官发生萎缩[30]。与模型组相比，CGS/CGSXyU低、高剂量组可提高免疫抑制小鼠的脾脏和胸腺指数。这表明CGS及CGSXyU可有效提升胸腺和脾脏指数，通过缓解免疫低下小鼠免疫脏器的萎缩实现其免疫调节作用的提高。Yang等[2]表明，大鲵蛋肌肉中富含具有免疫调节活性的短肽。与CGS相比，CGSXyU具有更强的免疫调节活性，这个结果与Chun等[31]研究结果一致，其表明添加由美拉德反应产生的β-乳球蛋白-乳糖偶联物被证明具有很强的免疫增强作用。
2.2.3 小鼠细胞因子分析
细胞因子大多为小分子可溶性蛋白质，通过刺激免疫细胞或非免疫细胞合成释放。其中Th1细胞分泌IFN-γ和TNF-α，IFN-γ是一种多效性细胞因子，负责巨噬细胞的激活和分化；TNF-α是T淋巴细胞和巨噬细胞细胞活化的关键介质，在诱导炎症介质中起重要作用[30]。IL-6和IL-10则是由Th2细胞分泌，主要通过辅助B细胞分化成为抗体分泌细胞，进而参与体液免疫应答。其中IL-10是免疫和炎症抑制因子；IL-6是一种多功能性细胞因子，有刺激B细胞增殖、分化并产生抗体的作用[32]。这四种细胞因子具有调节机体免疫应答的能力，机体的免疫状态可以通过这四种细胞因子进行反映。
小鼠血清中免疫因子含量的变化结果如图3所示，CTX诱导小鼠的IL-6、IL-10及TNF-α水平显著低于空白组（P<0.05），表明CTX可显著降低小鼠血清中的免疫因子；与模型组相比，CGSXyU-H中IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α水平均显著升高（P<0.05），表明CGSXyU-H可以显著促进小鼠血清中免疫因子的分泌，增强小鼠免疫功能。这个结果与小鼠免疫脏器指数结果一致。与CGS-H相比，CGSXyU-H中IL-10及TNF-α水平显著升高（P<0.05），而CGS-L/CGSXyU-L无显著差异（P>0.05），这个结果表明，小鼠中炎症因子水平受高浓度影响较大。
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图 3 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠细胞因子的影响Figure 3. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on cytokines of mice2.3 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠抗疲劳功能的影响
2.3.1 小鼠负重游泳实验分析
机体在长时间游泳后，体内糖原被快速消耗，导致血糖水平降低，能量输出减少，因此可以通过小鼠游泳时间的变化判断小鼠的耐运动疲劳能力是否得到提升[33]。作为评价抗疲劳功效的关键指标之一，小鼠游泳时间可以更直接反映样品真实的抗疲劳效果，力竭时间用来代表小鼠疲劳程度。
由图4可知，与空白组相比，CGS及CGSXyU处理组可显著延长小鼠力竭游泳时间（P<0.05）并且CGS-H及CGSXyU处理组高于阳性对照组（P<0.05）。其中，CGSXyU-H组延长时间最长。这说明CGS/CGSXyU具有延长小鼠力竭游泳时间的作用，具有一定的抗疲劳功效。这个结果与He等[3]研究结果一致，其表明CGS具有显著抗疲劳功效。
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图 4 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠负重游泳时间影响Figure 4. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the weight-bearing swimming time of mice2.3.2 小鼠尿素氮含量变化分析
尿素氮是氨基酸与蛋白质代谢的重要产物[34]。然而，大量运动引起含氮物质的分解加剧，尿素氮的含量增加，大量尿素积累引起机体疲劳。因此，尿素氮也常被用来评价抗疲劳功效的指标之一。此外，相关报道指出，机体的运动耐受力与体内尿素氮的含量呈现负相关性[35]。
如图5所示，与空白组相比，CGS-H、CGSXyU-L以及CGSXyU-H处理组的小鼠体内BUN含量显著降低（P<0.05），CGS低剂量组、CGSXyU低剂量组与阳性对照组之间不存在显著性差异（P>0.05）。这表明CGS-H和CGSXyU-L/H均可降低小鼠运动后BUN的积累，具有较好的抗疲劳功效。这个结果与Li等[4]研究结果一致，其表明大鲵来源的肽可以显著降低小鼠血BUN的含量。
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图 5 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠尿素氮含量影响Figure 5. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the urea nitrogen content in mice2.3.3 小鼠肌酸激酶变化分析
肌酸激酶（CK）通常大量存在于动物的肌肉、大脑、心脏及骨骼肌中，是一种与能量代谢密切相关的酶[36]。CK活力升高可以增加能量代谢和产生较多乳酸，影响运动能力[37]，在肌肉退化过程中，随着肌肉细胞的分解，CK被释放到血液中。因此，在体内血清中的CK活性常作为判断肌肉或骨骼肌是否受损、受刺激等的重要指标[38]。
如图6所示，CGS和CGSXyU给药组小鼠体内的CK活力与空白组相比显著降低（P<0.05）。与阳性对照组相比，CGS/CGSXyU组CK含量显著降低（P<0.05），但CGS与CGSXyU组之间无显著差异（P>0.05），这可能是CGS与CGSXyU提高了小鼠体内抗氧化酶的活性，清除超氧阴离子自由基[39]，从而可以在一定程度上改善急性运动引起的肌肉损伤。
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图 6 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血清肌酸激酶活性影响Figure 6. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on serum creatine kinase activity in mice2.3.4 小鼠血清乳酸变化分析
长时间的运动可以导致与疲劳相关代谢物的积累[40]，机体处于缺氧状态下，加速糖酵解的进程，产生大量的乳酸（LD）。乳酸大量堆积易带来肌肉收缩、肌力下降和体液偏酸等现象，这些现象均会加速疲劳的产生。因此，乳酸水平是反映机体疲劳程度及有氧代谢能力的重要指标[41]。
如图7所示，CGS和CGSXyU组小鼠体内的乳酸含量与于空白组相比均显著下降（P<0.05），其中CGS和CGSXyU高剂量组可以显著降低小鼠血液乳酸含量，这可能是因为高剂量的CGS和CGSXyU可以提高机体的有氧代谢能力，促进乳酸的快速清除，从而缓解疲劳[42]。CGSXyU高剂量组小鼠体内的乳酸含量比空白组低28.31%，效果最为显著（P<0.05）。上述结果说明CGS和CGSXyU可降低小鼠运动后乳酸的积累，具有显著的抗疲劳功效。
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图 7 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血液乳酸含量影响Figure 7. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the urea nitrogen content in mice2.3.5 小鼠体内抗氧化活性
分析人体内的内源性抗氧化剂包括一系列抗氧化酶类，这一系列酶可以消除自由基对于机体产生的氧化危害，从而使得机体处于氧化与抗氧化二者平衡的状态[43]。其中，SOD是机体抗氧化应激过程中最重要的酶，GSH-Px则被认为是体内最关键的过氧化物酶之一，它可以催化谷胱甘肽的产生[44]，进而参与过氧化反应，分解过氧化氢，并可与ROS反应，对缓解氧化应激同样具有重要作用[45−46]。因此，SOD与GSH-Px活性常被用于反映机体内的抗氧化活性。
CGS和CGSXyU给药组对小鼠体内SOD、GSH-Px的活力影响见图8。由图8可知，CGS和CGSXyU高剂量给药组的小鼠体内SOD、GSH-Px活力对比空白组显著提高（P<0.05），而低剂量的CGS与空白对照组小鼠体内SOD及GSH-Px活性并无显著差异（P>0.05）。以上结果表明，高剂量CGS和CGSXyU能促进小鼠体内抗氧化酶系活力的提高，清除运动过程中产生的自由基，具有较强的体内抗氧化活性，其中CGSXyU高剂量组效果最显著。
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图 8 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠体内抗氧化活性影响Figure 8. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on antioxidant activity in mice3. 结论
本研究从体内降糖降脂、增强免疫和抗疲劳等方面探讨大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物的营养功效，结果表明，大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物可有效调节Ⅱ型糖尿病小鼠血糖并降低TC、TG、LDL-C含量，提升HDL-C含量从而发挥血脂调节作用；通过对免疫因子及免疫器官发育的调控，促进机体免疫功能的恢复，从而发挥免疫调节作用；可延长小鼠力竭游泳时间，降低尿素氮、乳酸积累和肌酸激酶含量，提高体内抗氧化活性从而有效提升正常小鼠的抗疲劳能力。本结果揭示了蛋白肽及其美拉德反应产物对动物体内血糖血脂、免疫功能及抗疲劳功能活性影响，为功能性食品功能因子的开发提供了新的方法与思路，同时为提高大鲵附加值奠定了理论基础。然而，受生物体内复杂的吸收代谢系统影响，后续还需进行大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对体内血糖血脂、免疫功能及抗疲劳功能活性影响机制研究，以进一步阐明其在生物体内的吸收利用途径，促进大鲵蛋白肽的应用。
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图 2 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠免疫脏器指数影响
Figure 2. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the immune organ index of mice
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图 3 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠细胞因子的影响
Figure 3. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on cytokines of mice
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图 4 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠负重游泳时间影响
Figure 4. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the weight-bearing swimming time of mice
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图 5 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠尿素氮含量影响
Figure 5. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the urea nitrogen content in mice
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图 6 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血清肌酸激酶活性影响
Figure 6. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on serum creatine kinase activity in mice
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图 7 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血液乳酸含量影响
Figure 7. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on the urea nitrogen content in mice
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图 8 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠体内抗氧化活性影响
Figure 8. Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on antioxidant activity in mice
表 1 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠血糖影响
Table 1 Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on blood glucose levels in mice
组别 血糖浓度（mmol/L） 初始 建模1周 给药1周 给药2周 给药3周 C 5.20±0.20Aa 5.50±0.65Ba 4.97±0.47Ca 5.17±0.21Da 5.30±0.46Ea M 5.10±0.26ABb 23.70±3.40Aa 24.10±4.90Aa 24.50±3.16Aa 24.37±2.08Aa PC 4.80±0.30ABe 23.30±0.10Aa 19.63±1.46Bb 16.73±0.93Cc 14.37±0.42Dd CGS-L 4.37±0.21Bd 23.80±2.61Aa 22.77±0.15ABa 20.57±0.25Bb 17.90±0.20Bc CGS-H 4.97±0.058ABe 24.00±1.31Aa 21.33±0.15ABb 18.57±0.25BCc 15.63±0.31CDd CGSXyU-L 4.8±0.61ABd 23.67±1.62Aa 22.43±0.21ABa 19.53±0.15Bb 16.53±0.35BCc CGSXyU-H 5.4±0.85ABe 23.73±0.74Aa 20.5±0.30ABb 17.07±0.15Cc 14.8±0.17Dd 注：C，空白对照组；M，模型对照组；PC，阳性对照组；不同大写字母表示同一时间不同组别之间的显著性差异，P<0.05；不同小写字母表示同一组别不同时间之间小鼠空腹血糖的显著性差异，P<0.05。 
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表 2 大鲵蛋白肽及其美拉德反应产物对小鼠体重影响
Table 2 Effect of giant salamander protein peptide and its Maillard reaction product on body weight of mice
组别 初始体重（g） 造模体重（g） 最终体重（g） C 23.53±1.05b 24.96±1.13ab 25.60±0.74a M 23.07±0.26a 17.79±0.57c 19.06±0.74b PC 23.52±1.28a 18.33±0.45c 20.69±0.78b CGS-L 22.69±1.12a 18.36±1.47b 20.77±0.15a CGS-H 22.10±0.91a 17.61±1.20b 20.33±0.38a CGSXyU-L 22.40±0.43a 19.01±1.08b 21.43±0.77a CGSXyU-H 21.62±1.52a 18.68±0.45b 23.99±1.78a 注：C，空白对照组；M，模型对照组；PC，阳性对照组；不同小写字母表示同一组别不同时间之间小鼠体重的显著性差异，P<0.05。
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