Screening of Postbiotics against Salmonella and Whole Genome Analysis of the Original Strain
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摘要: 目的：筛选抗沙门氏菌效果良好的后生元，开发具有产业化价值的后生元原料。方法：测定30株乳酸菌后生元抑制鼠伤寒沙门氏菌生长的能力，筛选出效果最好的5株后生元。随后对这5株后生元抑制鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭HT-29细胞的能力进行测定，筛选出效果最显著的后生元，并对其原始菌株进行全基因组测序和安全性评价。结果：植物乳杆菌JM015后生元的抑菌圈直径达到15.12±0.53 mm，同时能有效降低鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭HT-29细胞90%以上。植物乳杆菌JM015的全基因组测序结果显示，其具有环内酯自诱导剂、萜类、核糖体合成和翻译后修饰肽-like和III型聚酮合酶等4个抑菌相关基因簇与1个与植物乳杆菌素的产生有关的基因簇。此外，其中还存在纤维连接蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和三糖-磷酸异构酶等多个黏附相关的编码基因。同时，经吲哚、溶血和硝酸盐还原酶活性等试验验证了植物乳杆菌JM015的安全性。结论：植物乳杆菌JM015后生元具有抗沙门氏菌的能力，可作为新的后生元原料用于产品开发。Abstract: Objective: To screen postbiotics with exceptional anti-Salmonella activity and develop postbiotic raw materials with industrialization value. Methodology: The anti-Salmonella potential of 30 Lactobacillus postbiotic strains was evaluated, focusing on their ability to inhibit the growth of Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST). The top five most effective strains were identified, and further assays were conducted to assess their capacity to inhibit ST adhesion and invasion in HT-29 cells. The most significant effective postbiotic was selected for whole genome sequencing and safety evaluation of its originating strain. Results: Lactobacillus plantarum (L. plantarum) JM015 postbiotic exhibited a notable inhibition zone diameter of 15.12±0.53 mm. It effectively reduced the adhesion and invasion of Salmonella to HT-29 cells by more than 90%. Whole genome sequencing of L. plantarum JM015 revealed four bacteriostasis-related gene clusters related to repression: cyclic-lactone-autoinducer, terpene, ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPP)-like, and Type III Polyketide synthases (PKS). Additionally, it harbors a gene cluster associated with plantaricin production and several genes linked to adhesion, such as fibronectin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), and triosephosphate isomerase. The safety of the original strain was confirmed through tests for indole production, hemolysis, and nitrate reductase activity. Conclusion: The L. plantarum JM015 postbiotic demonstrates potent anti-Salmonella activity and c as a novel postbiotic ingredient for product development.
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沙门氏菌是肠杆菌科的重要成员，通常与受污染的食物一起摄入或通过粪口途径传播，引起小肠结肠炎、肠热病以及菌血症等多种疾病[1]。有研究表明，每年约有9380万例沙门氏菌感染的食源性疾病，其中15.5万例死亡，被认为是人类食源性肠道疾病中最高的感染来源之一[2−4]。鼠伤寒沙门氏菌作为沙门氏菌的一种，能引起多种宿主感染。目前，使用抗生素是治疗感染沙门氏菌最常用的手段。但抗生素的使用导致沙门氏菌耐药性增强，加大临床治疗难度[5]。研究表明，沙门氏菌对抗耐药性呈现出每十年上升20%~30%的趋势，并且多重耐药菌株数量明显增加，故亟需限制抗生素的使用并寻求其他绿色干预方式[6]。
大量体外和体内实验表明益生菌可以有效防御沙门氏菌感染[7−10]。但益生菌作为活菌制剂，其活力受到温度、湿度和酸度等条件的影响，应用场景受限[11]。研究指出，益生菌对机体的作用不一定与活菌直接相关，起关键作用的极有可能是菌株代谢产物或菌体成分，这些对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂正式被国际益生菌和益生元科学协会（ISAPP）命名为后生元[12]。相较于益生菌，后生元具有安全、稳定、易于储藏以及作用靶点广泛等多项优点[13]。后生元能有效抑制致病菌的增殖。Rossoni等[14]证实了副干酪乳杆菌28.4的后生元成分能够抑制金黄色葡萄球菌增殖。Mohammadi等[15]采用气相色谱-质谱法研究后生元化学成分，发现其中存在某些抗菌和抗真菌化合物，对鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌和黄曲霉等具有广泛的抑菌能力。同时，后生元能够附着在肠道上皮细胞上，增强肠道屏障，抵御致病菌的黏附和进一步感染[16]。瑞士乳杆菌R0052的细胞壁组分抑制了大肠杆菌对上皮细胞的黏附[17]。Karbowiak等[18]对分离自食品中的乳酸菌进行热灭活处理，结果表明其有良好的自聚集特性，并且能够显著抑制单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌对猪胃黏蛋白的黏附。Khojah等[19]研究了分离自中东功能性脱乳清酸奶中的后生元，结果表明其对Caco-2细胞具有很强的黏附性，能够有效防止鼠伤寒沙门氏菌与Caco-2细胞结合。
目前，我国首个后生元团体标准T/CBFIA 09001-2023《益生菌制品 乳酸菌类 后生元》，对后生元产品原料提出要求：菌种需满足国家食品菌种名单规定，明确菌株号和来源，在菌株水平进行安全性评价，并且需全基因组测序及科学文献支持。因此，本研究通过筛选30株乳酸菌后生元对鼠伤寒沙门氏菌生长抑制的能力，以及它们对鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭HT-29细胞的抑制效果，得到效果最优的后生元。同时，对该后生元的原始菌株进行全基因组测序和安全性评价，为其进一步应用供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
试验菌株：本试验所用乳酸菌菌株选取自东北农业大学乳品科学重点实验室自主分离和保藏的菌株，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028来自东北农业大学乳品科学重点实验室保藏，如表1所示。
表 1 试验菌株Table 1. Strains of the test试验菌株 编号 来源 鼠李糖乳杆菌 19-1、19-36、20-3、20-37、
20-1、JL-1健康婴儿粪便 嗜酸 NCFM 健康婴儿粪便 格式乳杆菌 JM1 健康婴儿粪便 副干酪乳杆菌 15-1、92-3、TD095、100-1、
M-11-6、TD062、062西藏地区传统发酵乳制品 罗伊氏 J1 西藏地区传统发酵乳制品 植物乳杆菌 100-4、64-10、63-16、62-15、
JM015、43-11、J26、64-14西藏地区传统发酵乳制品 短乳杆菌 2、3、4、11、ZW、HDBR 西藏地区传统发酵乳制品 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 本实验室保藏 HT-29细胞购买于中国科学院细胞库。脱纤维绵羊血（无菌），DMEM高糖培养液，胎牛血清，胰酶 北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖 山东卓望生物工程有限公司；酵母抽提物 安琪酵母股份有限公司；吐温80 汇泉生物科技有限公司；硫酸锰 上海德华食品添加剂有限公司；磷酸氢二钾 四川金地亚美科技有限公司；LB肉汤培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302） 天根生化科技（北京）有限公司；抗生素药敏片 杭州微生物试剂有限公司。
电热恒温水浴锅 上海精密仪器仪表有限公司；电热恒温培养箱DHP-9272 上海一恒科技有限公司；菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪 杭州讯数科技有限公司；HF90 CO2培养箱 香港力康发展有限公司；Delta 1-24 LSC冷冻干燥机 德国Christ公司。
1.2 实验方法
1.2.1 可食用培养基配制
根据文献改良可食用培养基[20]，配比如下：20 g葡萄糖、27.84 g酵母抽提物、5.75 g乙酸钠、1.12 g吐温80、0.05 g硫酸锰以及2.5 g磷酸氢二钾。将上述物质均匀混合后加入1 L蒸馏水121 ℃灭菌15 min备用。
1.2.2 菌株活化及样品制备
1.2.2.1 乳酸菌活化
将乳酸菌菌株以5%接种量接种于改良培养基中，37 ℃培养16 h，传代2次备用。
1.2.2.2 沙门氏菌活化
将鼠伤寒沙门氏菌以2%接种量接种于LB液体培养基中，37 ℃培养6 h，传代2次后在4 ℃条件下8000 r/min离心5 min，弃去上清收集菌体用无菌PBS洗涤3次，用PBS/DMEM重悬至108 CFU/mL。
1.2.2.3 后生元制备
将传代两次的发酵液（109 CFU/mL）放置于80 ℃水浴锅中加热30 min，进行热灭活处理。冷却后的灭活发酵液置于−80 ℃预冷冻24 h后，放入真空冷冻干燥机中冻干成粉。按照冻干前的体积将一定量的冻干粉用PBS/DMEM重悬至原体积（109 CFU/mL），其余冻干粉放置−20 ℃储藏。
1.2.3 后生元抑菌能力测定
采用双层平板打孔法：将1.2%的琼脂倾倒于无菌平皿中晾干，每皿10 mL；配置含0.7%琼脂的LB肉汤培养基，将鼠伤寒沙门氏菌以0.6%的接种量接入后，按6 mL每皿倾倒于底层琼脂上；晾干后打孔，每孔加入100 μL后生元，在超净工作台中扩散3 h后，置于适宜条件下培养后用抑菌圈测量仪器定抑菌圈直径[21]。
1.2.4 细胞实验
1.2.4.1 细胞活化
HT-29细胞接入含20%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于CO2培养箱37 ℃孵育直至形成致密细胞层，添加0.25%胰酶消化传代，每隔3天传代，传代5次后用于黏附试验[22]。
1.2.4.2 后生元对沙门氏菌黏附能力的抑制作用
调整细胞浓度至2×104 cells/mL后接种至12孔培养板，置于CO2培养箱37 ℃培养长成致密细胞层，经PBS缓冲液洗2次，加入1 mL DMEM和200 μL后生元（对照组加入不含后生元的DMEM）培养2 h后再加入200 μL沙门氏菌。继续培养2 h后用PBS清洗5次，每孔加入200 μL胰酶，孵育2 min后，用移液器吹打均匀。0~10−3梯度稀释、LB营养琼脂计数[23]。
1.2.4.3 后生元对沙门氏菌侵袭能力的抑制作用
调整细胞浓度至2×104 cells/mL后接种至12孔培养板, 置于CO2培养箱37 ℃培养长成致密细胞层，经PBS缓冲液洗2次，加入1 mL DMEM和200 μL后生元（对照组加入不含后生元的DMEM）培养2 h后再加入200 μL沙门氏菌。继续培养2 h后用PBS清洗5次，按1 mL每孔加入200 ug/ml庆大霉素溶液孵育30 min以杀死胞外细菌，按照1.2.4.2中方法对沙门氏菌进行计数[23]。
1.2.5 全基因组测序
1.2.5.1 测定方法
按照细菌DNA试剂盒说明书提取菌株的总DNA，送至凌恩生物公司进行测序。采用全基因组鸟枪法策略构建文库，利用第二和第三代测序技术，分别对文库进行测序。
1.2.5.2 生物信息学分析
下机后对测序数据进行质控，剔除低质量数据，对数据进行组装，多次调整参数及补洞后获得完整的基因组序列。采用GeneMarkS软件进行编码基因预测，与通用功能数据库比对，注释编码基因。同时将预测基因的蛋白质序列分别与直系同源聚类群（Clusters of Orthologous Groups，COG）、基因本体论（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等数据库进行BLAST比对，对菌株的基因功能进行预测分析。
1.2.5.3 抑菌和黏附相关基因分析
利用AntiSMASH 7.0和BAGEL4分析潜在的细菌素合成基因簇及关键蛋白。使用Diamond Blastp将基因编码蛋白序列与NCBI数据库中黏附相关的蛋白序列进行比对和功能注释。
1.2.5.4 毒力因子和抗生素抗性基因分析
采用BLAST软件，将基因编码蛋白序列与毒力因子相关基因数据库（VFDB）以及抗生素抗性数据库（CARD）进行比对，预测在基因组中与毒力因子以及抗生素抗性相关的基因。
1.2.6 安全性评价
1.2.6.1 吲哚试验
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）JM015和阳性对照Escherichia coli（E. coli）ATCC 25922分别以5%接种量接种于胰蛋白水培养基中，37 ℃培养72 h后加入9滴Kovacs氏靛基质试剂观察结果。若在培养基上部有一红色环则为阳性，若为黄色或棕色则为阴性[24]。
1.2.6.2 硝酸盐还原酶检测
将L. plantarum JM015和E.coli ATCC 25922分别以5%的接种量接种到硝酸盐培养基中，37 ℃培养5天后，先后滴加5%的碘化钾和淀粉溶液10滴，观察结果。若培养基溶液呈蓝色，则为阳性；溶液不变色，则为阴性[25]。
1.2.6.3 溶血试验
向灭菌冷却至50 ℃的哥伦比亚血琼脂中加入5%的脱脂纤维羊血，混匀顷到无菌血平板，用接种环将L. plantarum JM015和阳性对照Staphylococcus aureus（S. aureus）ATCC 25923划线于血平板上，37 ℃培养48 h。若在菌落周围出现透明圈，为β-溶血；无溶血作用，为γ-溶血[26]。
1.2.6.4 药物敏感性试验
将L. plantarum JM015稀释到1.5×108 CFU/mL，涂布于MRS固体培养基中，将抗生素药敏纸片放置在培养基表面，37 ℃培养18 h后，测量抑菌圈直径。根据《药敏试验标准》判断抗生素敏感情况[27]。
1.3 数据分析
本文中实验均进行了三次平行，数据采用SPSS 2.0软件进行单因素方差分析，结果以平均差±标准差（Mean±SD）进行表示，其中P<0.05表示显著差异，采用Origin 9.0和GraphPad 8.0软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 后生元抑菌能力测定
后生元可有效地抑制病原菌的生长和繁殖，进一步维持宿主肠道微生态菌群稳定，对保障宿主健康具有重要作用[28]。本文利用双层平板打孔法对30株乳酸菌后生元抑菌能力进行测定，筛选对鼠伤寒沙门氏菌抑制能力较好的乳酸菌后生元。结果如图1所示，抑菌圈直径主要分布在8~15 mm，其中L. rhamnosus 20-37、L. plantarum 100-4、L. plantarum 62-15、L. plantarum JM015、L. plantarum 64-14平均抑菌圈直径为14.13±0.14 mm、14.91±0.30 mm、14.06±0.46 mm、15.12±0.53 mm和14.44±0.33 mm，显著高于其他菌株（P<0.05），不同后生元抑菌能力不同可能是由于菌株产生的代谢物不同，导致后生元成分的差异进而影响抑菌能力。初步筛选出抑菌效果较好的5株乳酸菌后生元进行后续试验。
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图 1 不同后生元对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径注：不同字母表示数据之间的差异显著，P<0.05。Figure 1. Diameter of inhibition zone of different Postbiotics to ST2.2 后生元对鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭能力的抑制作用
在宿主胃肠道中存活下来的鼠伤寒沙门氏菌会黏附到肠上皮并借助其表达的毒力蛋白侵入肠上皮细胞内，在宿主细胞内生存、复制引起进一步的感染[29]。因此，沙门氏菌黏附和侵袭肠上皮细胞通常被认为是感染宿主的开端。本试验建立鼠伤寒沙门氏菌感染HT-29细胞模型，研究后生元对其黏附和侵袭肠上皮细胞的抑制作用。
由图2a可知，与对照组相比，后生元预处理显著抑制了鼠伤寒沙门氏菌黏附HT-29细胞（P<0.05）；L. rhamnosus 20-37、L. plantarum JM015、L. plantarum 64-14预处理的效果显著（P<0.05）优于L. rhamnosus 100-4和L. rhamnosus 62-15，使鼠伤寒沙门氏菌黏附HT-29细胞的数量从4.1×105 CFU/孔降低至不足1×105 CFU/孔，抑制率达到90%以上。
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图 2 后生元对鼠伤寒沙门氏菌黏附（A）和侵袭（B） HT-29细胞的影响注：不同字母表示数据之间的差异显著，P<0.05。Figure 2. Effects of Postbiotics on adhesive(A) and invasive(B) ability of ST to HT-29 cells如图2b所示，鼠伤寒沙门氏菌具有入侵HT-29细胞并在其中存活的能力，各组后生元均显著（P<0.05）降低了HT-29细胞内的鼠伤寒沙门氏菌数量。其中，L. plantarum JM015后生元在黏附抑制方面与L. rhamnosus 20-37和L. plantarum 64-14后生元相比无显著差异（图2a），但其将HT-29细胞内的沙门氏菌数量从3×104 CFU/孔降低至5.7×10 CFU/孔，降幅达3个数量级，这一效果显著（P<0.05）优于其他后生元。结果表明L. plantarum JM015后生元能够有效地抑制鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭HT-29细胞，显示出良好的抗鼠伤寒沙门氏菌潜力。
根据T/CBFIA 09001-2023这一团体标准对后生元的要求，L. plantarum JM015后生元符合国家颁布的《可用于食品的菌种名单》，并且有明确分离来源和菌株编号。因此，根据后生元共识，后续实验将对L. plantarum JM015菌株进行全基因组测序及安全性分析。
2.3 全基因组分析
2.3.1 全基因组序列分析
采用cgview绘制L. plantarum JM015基因组的圈图，如图3所示，该菌株的基因组由1个染色体和9个质粒组成，均已成环，其片段总长度为3353268 bp，GC含量为44.49%，共包含3344个编码基因，占整个基因组的83.8%。L. plantarum JM015原始测序数据已提交至NCBI SRA数据库，登录号为SRX24922987（二代ILLUMINA）和SRX24922988（三代PACBIO_SMRT）。
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图 3 L. plantarum JM015基因组圈图注：从外到内，第一圈代表刻度；第二圈和第三圈为每一个编码序列所属的COG分类；第四圈为rRNA和tRNA；第五圈为GC含量；最内一圈为GC skew值。Figure 3. The genome cycle graph of L. plantarum JM0152.3.2 基因功能注释
L. plantarum JM015的COG功能注释分类图如图4A所示，主要注释到转录（281个）、碳水化合物运输和代谢（240个）及氨基酸运输和代谢（225个）等功能中。如图4B所示为 L. plantarum JM015的GO功能注释分类，分为描述基因的分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）和参与的生物学过程（biological process）的三类。在L. plantarum JM015中主要注释到细胞过程（505个）、代谢过程（434个）、催化活性（385个）、结合（226）和含蛋白质复合物（110个）等分类中。图4C为L. plantarum JM015的KEGG数据库功能注释分布情况。L. plantarum JM015的基因主要注释于薄膜运输（134个）、碳水化合物代谢（206个）和氨基酸的代谢（139个）等代谢途径中。
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图 4 菌株的COG 注释（A）、GO 注释（B）及 KEGG 注释（C）结果注：图C中不同字母表明基因参与的KEGG代谢通路分支：细胞过程（A，Metabolism），环境信息处理（B，Genetic Information Processing），遗传信息处理（C，Environmental Information Processing），代谢（D，Cellular Processes），有机系统（E，Organismal Systems）。Figure 4. Results of COG annotation (A), GO annotation (B) and KEGG annotation (C)研究指出，乳酸菌主要通过两种方式影响致病菌感染：一是抑制致病菌的生长，二是阻止其黏附[30]。乳酸菌能够分泌有机酸、过氧化氢和细菌素等抑菌物质，从而有效抑制致病菌的繁殖。同时，它还会与致病菌竞争宿主细胞的结合位点，进而抑制致病菌的黏附。碳水化合物和氨基酸的运输与代谢在这一过程中起着关键作用，它们是调控抑菌物质及黏附相关蛋白产生的主要机制[31,32]。根据COG、GO和KEGG的分析结果，可以观察到与这些代谢过程相关的基因存在。因此，为了进一步理解乳酸菌的抑菌特性，需要深入分析和研究这些与抑菌功能紧密相关的具体编码基因。
2.3.3 抗菌相关基因分析
全基因组序列的便利性和基因组分析技术的灵活性使抗菌化合物的预测成为可能。抗菌活性是益生菌抵抗致病菌感染的重要因素[33]。使用AntiSMASH 7.0和BAGEL 4.0工具发现L. plantarum JM015基因组中假定的抗菌化合物相关基因，进而推断菌株的抗菌潜力[34−35]。如图5所示，通过AntiSMASH 鉴定发现了环内酯自诱导剂、萜类、核糖体合成和翻译后修饰肽 （ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide，RiPP）-like和III型聚酮合酶（polyketide synthases， PKS）等4个与抑菌相关的基因簇[36−40]。如图6所示，利用BAGEL 4.0在该菌株中发现了一个植物乳杆菌素的产生有关的基因簇，包括两个关键蛋白植物乳杆菌素E和植物乳杆菌素F。植物乳杆菌细菌素 EF是植物乳杆菌产生的IIb类细菌素[41]，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌均有较强的抗菌活性[42]，因其可生物降解、无耐药性和低溶血活性而被普遍认为是安全的，并被认为是抵御病原体和细菌引起的食物腐败的天然屏障，可以应用于食品工业以控制食源性病原体的传播，减少食源性病原体的危害[43]。
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图 5 AntiSMASH7.0数据库预测的L. plantarum JM015的潜在抗菌基因集群Figure 5. Potential antimicrobial gene clusters of L. plantarum JM015 predicted by antiSMASH 7.0 database![]()
图 6 植物乳植杆菌JM015基因组BAGEL4比对结果Figure 6. Comparison of the genome of L. plantarum JM015 in BAGEL42.3.4 黏附相关基因分析
益生菌的益生效应与其黏附肠黏膜和上皮细胞的程度直接相关[44]。益生菌含有特异性黏附蛋白，如粘蛋白和纤维蛋白原结合蛋白，可沉降到胃肠道系统，促进其定植，抑制致病性黏附[45−47]。通过搜索L. plantarum JM015黏附基因发现其含有与人类肠细胞黏附相关的纤维连接蛋白、纤维连接蛋白和鞭毛钩相关蛋白编码基因。此外，还注释得到了编码甘油醛3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和三糖-磷酸异构酶（Triosephosphate isomerase，TPI）的基因。研究表明，GAPDH和TPI可以从细胞中释放出来，促进与肠上皮胞的黏附，避免其他致病菌的黏附[48−49]。这些黏附基因的存在可以帮助L. plantarum JM015在肠道定植，发挥潜在益生作用。
益生菌的黏附特性已被确定为对抗致病菌的保护机制[50]。而后生元对致病菌黏附的抑制作用机理并不完全清楚。细胞的热失活可能导致细胞壁破裂，从而释放某些细胞内容物以及细胞壁成分，如肽聚糖、脂质胆酸或热不稳定的菌毛等，这些细菌成分可能抑制致病菌的黏附[51−52]。一些研究表明后生元相比益生菌其抵抗致病菌黏附的作用更强，但不同菌株和不同灭活方式结果可能不同[53−54]。此外，大量实验表明后生元的抗致病菌黏附能力与其原始菌株黏附抑制能力直接相关。全基因组测序结果一定程度上解释了L. plantarum JM015后生元抑制鼠伤寒沙门氏菌黏附能力的来源。
表 2 L. plantarum JM015编码的黏附相关蛋白Table 2. Adhesion related proteins encoded by L. plantarum JM015基因位点 功能描述 L. plantarumJM015001616 Fibronectin-binding （FbpB） L. plantarumJM015002182 peptidoglycan hydrolase （FlgJ） L. plantarumJM015001615 Fibronectin-binding （FbpA） L. plantarumJM015002475 Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase （GAPDH）L. plantarumJM015002473 Triosephosphate isomerase （TPI） 2.3.5 毒力因子和抗生素抗性基因分析
毒力因子是指能够帮助生物体侵入宿主并增强其引起疾病潜力的因子。如表3所示，在 L. plantarum JM015 的基因组中存在5个毒力基因位点，其中1个存在于质粒中，主要与免疫逃逸、黏附侵袭、监管和酶等有关，并无与毒素产生相关的基因。如表4所示，L. plantarumJM015的基因组中存在能够使菌株对氟喹诺酮类、糖肽类素、大环内酯类抗生素等具有抗性的编码基因，分布在染色体和P4质粒上。有研究表明，乳酸菌通过质粒传递耐药基因，存在质粒中的抗性基因可能会随着消费者食用乳酸菌制品转移至人体肠道存在潜在的安全风险[55−56]。而后生元作为无生命的益生菌制品能够很好的规避掉这一风险[57]。后续通过药敏性实验验证L. plantarum JM015的耐药性基因的表达情况，并且通过体外安全性评价相关试验验证其是否有有害代谢物产生。
表 3 毒力相关基因分析Table 3. Analysis of virulence related genes基因位点 数据库编码 编码基因 类别 L. plantarumJM015001299 VFG016490 tuf 黏附侵袭 L. plantarumJM015001806 VFG006826 lisR 监管 L. plantarumJM015002472 VFG005582 eno 酶 L. plantarumJM015002504 VFG005871 hasC 免疫逃逸 L. plantarumJM015003114（p2） VFG006022 rfbB, rmlB, rffG 免疫逃逸 注：p2代表位于2号质粒上，其余未标注位于染色体上。 表 4 抗生素抗性基因分析Table 4. Gene analysis of antibiotic resistance基因位点 编码基因 抗生素类型 L.plantarumJM015000030
L.plantarumJM015001357
L.plantarumJM015000380van 糖肽抗菌素 L.plantarumJM015000448 patA 氟喹诺酮类抗生素 L.plantarumJM015000475 macB 大环内酯类抗生素 L.plantarumJM015000574 L.plantarumJM015000973 msbA 硝基咪唑抗生素 L.plantarumJM015000640 tetA（60） 四环素类抗生素 L.plantarumJM015000641 tetB（60） 四环素类抗生素 L.plantarumJM015001062 efrA 大环内酯类抗生素、利福霉素类抗生素、
氟喹诺酮类抗生素L.plantarumJM015000449 L.plantarumJM015001063 lmrD 林可酰胺抗生素 L.plantarumJM015000639 L.plantarumJM015001462 L.plantarumJM015002427
L.plantarumJM015003239（p4）lmrB 核苷抗生素，林可酰胺抗生素 L.plantarumJM015002731 novA 氨基香豆素抗生素 L.plantarumJM015000627 L.plantarumJM015002533 L.plantarumJM015000948 optrA 苯酚抗生素，恶唑烷酮抗生素 L.plantarumJM015002902 vgaC 链菌素类抗生素、残侧耳素类抗生素、链菌素A类抗生素、
林可胺类抗生素L.plantarumJM015001295 L.plantarumJM015002980 mdtG 膦酸抗生素 L.plantarumJM015003273（p4） pmrF 肽抗生素 注：p4代表位于4号质粒上，其余未标注位于染色体上。 2.4 安全性实验结果
2.4.1 吲哚、硝酸盐还原酶活性及溶血试验结果
色氨酸作为人体必需氨基酸是菌群-宿主间的桥梁物质，在促进宿主肠道健康中具有重要作用[58]。细菌代谢产生色氨酸酶会导致色氨酸代谢紊乱进而引起肿瘤、炎症性肠病和肾脏疾病等问题[59]。如图7A所示，吲哚试验显示阳性对照E. coli ATCC 25922能产生色氨酸酶，分解培养基中的色氨酸产生吲哚，与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，产生红色色环。而L. plantarum JM015与空白对照均没有颜色变化，说明L. plantarum JM015不产生色氨酸酶。
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图 7 吲哚（A）、硝酸盐还原酶活性（B）及溶血（C）试验结果图Figure 7. Results of indole (A), nitrate reductase activity (B) and hemolysis (C) test硝酸盐还原酶试验检测菌株是否产生硝酸盐还原酶，硝酸盐在硝酸盐还原酶的作用下还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐被人体食用后，在胃酸作用下与蛋白质分解产物反应生成亚硝胺，亚硝胺具有致癌作用[60]。如图7B所示，E. coli具有硝酸盐还原酶活性，还原碘化钾，进而导致淀粉溶液变为蓝色。而L. plantarum JM015和空白对照溶液没有变色，不具有硝酸盐还原酶活性。
溶血性试验检测菌株是否产生溶血素，溶血素会溶解红细胞，造成血小板损伤，危害人体健康导致贫血等疾病[61−62]。如图7C所示，S. aureus培养后出现透明溶血圈，为β-溶血。L. plantarum JM015培养后没有溶血环，为γ-溶血，不具有溶血能力。
2.4.2 药物敏感性试验
微生物对抗生素的敏感性是检测微生物安全性最重要实验的之一。本实验选取临床常用的7类抗生素：β-内酰胺类、头孢类、糖肽类、氨基糖疳类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类。
如表5所示，L. plantarum JM015抗生素敏感性试验证实了其对氨苄西林、麦迪霉素、多西环素和氯霉素等12种抗生素具有敏感性，对丁胺卡那和四环素2种抗生素中度敏感；对环丙沙星、诺氟沙星和万古霉素等4种抗生素具耐药性。与前文L. plantarum JM015全基因组中抗生素抗性基因分析结果基本相符，主要对糖肽类抗生素和氟喹诺酮类抗生素耐药。
表 5 L. plantarum JM015耐药性结果Table 5. Drug resistance results of L. plantarum JM015抗生素类别 抗生素名称 抑菌圈直径折点（mm） 抑菌圈直径 （mm） 敏感程度 耐药R 中介I 敏感S β-内酰胺类 氨苄西林 ≤13 14-16 ≥17 32.88±0.33 S 羧苄西林 ≤19 20-22 ≥23 29.173±1.50 S 哌拉西林 ≤17 18-20 ≥21 36.26±2.11 S 头孢类 头孢唑啉 ≤14 15-17 ≥18 26.82±0.07 S 头孢哌酮 ≤15 16-20 ≥21 21.97±0.54 S 头孢曲松 ≤13 14-20 ≥21 27.75±1.30 S 糖肽类 万古霉素 ≤14 15-16 ≥17 0.00 R 氨基糖疳类 丁胺卡那 ≤14 15-16 ≥17 15.74±0.93 I 庆大霉素 ≤12 13-14 ≥15 15.82±0.64 S 新霉素 ≤12 13-16 ≥17 17.78±0.34 S 大环内酯类 红霉素 ≤13 14-22 ≥23 24.24±0.32 S 麦迪霉素 ≤13 14-17 ≥18 23.15±0.98 S 四环素类 四环素 ≤14 15-18 ≥19 16.95±0.19 I 多西环素 ≤12 13-15 ≥16 19.03±1.58 S 喹诺酮类 环丙沙星 ≤15 16-20 ≥21 10.82±0.28 R 诺氟沙星 ≤12 13-16 ≥17 0.00 R 氧氟沙星 ≤12 13-15 ≥16 12.80±0.83 R 氯霉素 ≤12 13-17 ≥18 25.59±0.31 S 注：表中S代表敏感、I代表中度敏感、R代表耐药。 3. 结论
本研究通过抑菌和细胞实验筛选出抗沙门氏菌效果好的后生元，并对其原始菌株进行全基因组测序和安全性评价。结果表明，L. plantarum JM015后生元能有效抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长以及黏附和侵袭HT-29细胞。L. plantarum JM015全基因组中发现多个与抑菌相关的基因簇以及黏附相关编码基因，并且无毒素产生相关的基因和抗生素抗性基因转移的风险。同时L. plantarum JM015不产生色氨酸酶和硝酸盐还原酶，不具备溶血能力，对常见抗生素敏感。因此，L. plantarum JM015后生元应用于鼠伤寒沙门氏菌的防控中十分的安全可行。本研究为L. plantarum JM015后生元作为新的后生元原料用于预防鼠伤寒沙门氏菌感染提供理论基础，未来的研究可在此基础上结合体内动物研究深入探讨JM015生元抗沙门氏菌的作用靶点和机制，以进一步为L. plantarum JM015后生元的开发和利用提供更为科学的依据。
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图 1 不同后生元对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径
注：不同字母表示数据之间的差异显著，P<0.05。
Figure 1. Diameter of inhibition zone of different Postbiotics to ST
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图 2 后生元对鼠伤寒沙门氏菌黏附（A）和侵袭（B） HT-29细胞的影响
注：不同字母表示数据之间的差异显著，P<0.05。
Figure 2. Effects of Postbiotics on adhesive(A) and invasive(B) ability of ST to HT-29 cells
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图 3 L. plantarum JM015基因组圈图
注：从外到内，第一圈代表刻度；第二圈和第三圈为每一个编码序列所属的COG分类；第四圈为rRNA和tRNA；第五圈为GC含量；最内一圈为GC skew值。
Figure 3. The genome cycle graph of L. plantarum JM015
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图 4 菌株的COG 注释（A）、GO 注释（B）及 KEGG 注释（C）结果
注：图C中不同字母表明基因参与的KEGG代谢通路分支：细胞过程（A，Metabolism），环境信息处理（B，Genetic Information Processing），遗传信息处理（C，Environmental Information Processing），代谢（D，Cellular Processes），有机系统（E，Organismal Systems）。
Figure 4. Results of COG annotation (A), GO annotation (B) and KEGG annotation (C)
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图 5 AntiSMASH7.0数据库预测的L. plantarum JM015的潜在抗菌基因集群
Figure 5. Potential antimicrobial gene clusters of L. plantarum JM015 predicted by antiSMASH 7.0 database
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图 6 植物乳植杆菌JM015基因组BAGEL4比对结果
Figure 6. Comparison of the genome of L. plantarum JM015 in BAGEL4
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图 7 吲哚（A）、硝酸盐还原酶活性（B）及溶血（C）试验结果图
Figure 7. Results of indole (A), nitrate reductase activity (B) and hemolysis (C) test
表 1 试验菌株
Table 1 Strains of the test
试验菌株 编号 来源 鼠李糖乳杆菌 19-1、19-36、20-3、20-37、
20-1、JL-1健康婴儿粪便 嗜酸 NCFM 健康婴儿粪便 格式乳杆菌 JM1 健康婴儿粪便 副干酪乳杆菌 15-1、92-3、TD095、100-1、
M-11-6、TD062、062西藏地区传统发酵乳制品 罗伊氏 J1 西藏地区传统发酵乳制品 植物乳杆菌 100-4、64-10、63-16、62-15、
JM015、43-11、J26、64-14西藏地区传统发酵乳制品 短乳杆菌 2、3、4、11、ZW、HDBR 西藏地区传统发酵乳制品 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 本实验室保藏 
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表 2 L. plantarum JM015编码的黏附相关蛋白
Table 2 Adhesion related proteins encoded by L. plantarum JM015
基因位点 功能描述 L. plantarumJM015001616 Fibronectin-binding （FbpB） L. plantarumJM015002182 peptidoglycan hydrolase （FlgJ） L. plantarumJM015001615 Fibronectin-binding （FbpA） L. plantarumJM015002475 Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase （GAPDH）L. plantarumJM015002473 Triosephosphate isomerase （TPI）
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表 3 毒力相关基因分析
Table 3 Analysis of virulence related genes
基因位点 数据库编码 编码基因 类别 L. plantarumJM015001299 VFG016490 tuf 黏附侵袭 L. plantarumJM015001806 VFG006826 lisR 监管 L. plantarumJM015002472 VFG005582 eno 酶 L. plantarumJM015002504 VFG005871 hasC 免疫逃逸 L. plantarumJM015003114（p2） VFG006022 rfbB, rmlB, rffG 免疫逃逸 注：p2代表位于2号质粒上，其余未标注位于染色体上。
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表 4 抗生素抗性基因分析
Table 4 Gene analysis of antibiotic resistance
基因位点 编码基因 抗生素类型 L.plantarumJM015000030
L.plantarumJM015001357
L.plantarumJM015000380van 糖肽抗菌素 L.plantarumJM015000448 patA 氟喹诺酮类抗生素 L.plantarumJM015000475 macB 大环内酯类抗生素 L.plantarumJM015000574 L.plantarumJM015000973 msbA 硝基咪唑抗生素 L.plantarumJM015000640 tetA（60） 四环素类抗生素 L.plantarumJM015000641 tetB（60） 四环素类抗生素 L.plantarumJM015001062 efrA 大环内酯类抗生素、利福霉素类抗生素、
氟喹诺酮类抗生素L.plantarumJM015000449 L.plantarumJM015001063 lmrD 林可酰胺抗生素 L.plantarumJM015000639 L.plantarumJM015001462 L.plantarumJM015002427
L.plantarumJM015003239（p4）lmrB 核苷抗生素，林可酰胺抗生素 L.plantarumJM015002731 novA 氨基香豆素抗生素 L.plantarumJM015000627 L.plantarumJM015002533 L.plantarumJM015000948 optrA 苯酚抗生素，恶唑烷酮抗生素 L.plantarumJM015002902 vgaC 链菌素类抗生素、残侧耳素类抗生素、链菌素A类抗生素、
林可胺类抗生素L.plantarumJM015001295 L.plantarumJM015002980 mdtG 膦酸抗生素 L.plantarumJM015003273（p4） pmrF 肽抗生素 注：p4代表位于4号质粒上，其余未标注位于染色体上。
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表 5 L. plantarum JM015耐药性结果
Table 5 Drug resistance results of L. plantarum JM015
抗生素类别 抗生素名称 抑菌圈直径折点（mm） 抑菌圈直径 （mm） 敏感程度 耐药R 中介I 敏感S β-内酰胺类 氨苄西林 ≤13 14-16 ≥17 32.88±0.33 S 羧苄西林 ≤19 20-22 ≥23 29.173±1.50 S 哌拉西林 ≤17 18-20 ≥21 36.26±2.11 S 头孢类 头孢唑啉 ≤14 15-17 ≥18 26.82±0.07 S 头孢哌酮 ≤15 16-20 ≥21 21.97±0.54 S 头孢曲松 ≤13 14-20 ≥21 27.75±1.30 S 糖肽类 万古霉素 ≤14 15-16 ≥17 0.00 R 氨基糖疳类 丁胺卡那 ≤14 15-16 ≥17 15.74±0.93 I 庆大霉素 ≤12 13-14 ≥15 15.82±0.64 S 新霉素 ≤12 13-16 ≥17 17.78±0.34 S 大环内酯类 红霉素 ≤13 14-22 ≥23 24.24±0.32 S 麦迪霉素 ≤13 14-17 ≥18 23.15±0.98 S 四环素类 四环素 ≤14 15-18 ≥19 16.95±0.19 I 多西环素 ≤12 13-15 ≥16 19.03±1.58 S 喹诺酮类 环丙沙星 ≤15 16-20 ≥21 10.82±0.28 R 诺氟沙星 ≤12 13-16 ≥17 0.00 R 氧氟沙星 ≤12 13-15 ≥16 12.80±0.83 R 氯霉素 ≤12 13-17 ≥18 25.59±0.31 S 注：表中S代表敏感、I代表中度敏感、R代表耐药。
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