Effects of Different Preparation Methods on Protein Structure and Functional Properties of Konjac Fly Powder
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摘要: 魔芋飞粉是魔芋精粉加工的主要副产物，富含丰富的蛋白质。为提高飞粉蛋白质利用率，本研究采用碱溶酸沉、低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）-透析法和DESs-醇沉法制备3种飞粉蛋白质，并利用SDS-PAGE电泳、扫描电镜、紫外与红外光谱等方法探究制备方法对蛋白质结构和功能特性的影响。结果表明，3种方法制备的蛋白质纯度为67.8%~85.3%，且主要由10~55 kDa的低分子量亚基组成。与传统的碱溶酸沉法相比，DESs提取的飞粉蛋白质分子量组成并未发生改变，但二级结构相对含量发生显著变化。热重分析曲线显示3种飞粉蛋白质在300 ℃左右均发生热降解，其中DESs-透析法的飞粉蛋白质热稳定性最佳（316 ℃）。此外，DESs提取的蛋白质功能特性均优于碱溶酸沉法，其中DESs-透析的蛋白质具有更好的持水持油性和乳化性能。本研究将为拓展魔芋飞粉蛋白在食品工业生产中的应用提供数据支撑。
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关键词:
- 魔芋飞粉 /
- 蛋白质 /
- 低共熔溶剂(DESs) /
- 结构特征 /
- 功能性质
Abstract: Konjac fly powder is the primary by-product of konjac refined flour processing, containing an abundance of proteins. In this study, three types of konjac fly powder proteins were prepared using alkaline extraction and acid precipitation, deep eutectic solvents (DESs)-dialysis and DESs-alcohol precipitation to enhance protein utilization. The impact of the preparation methods on the structural and functional properties of the proteins was investigated using SDS-PAGE, scanning electron microscopy, as well as UV and IR spectroscopy. The results revealed that the purity of the proteins prepared by the three methods ranges from 67.8% to 85.3%, mainly consisting of low molecular weight subunits in the range of 10~55 kDa. In comparison with the traditional alkaline extraction and acid precipitation, the molecular weight composition of the konjac proteins extracted by DESs remained unchanged, but there was a significant alteration in the relative content of the secondary structure. The TGA curves reveal that all three types of konjac proteins underwent thermal degradation at approximately 300 ℃, with the protein extracted through DESs-dialysis exhibiting the highest thermal stability at 316 ℃. Furthermore, the functional properties of proteins extracted by DESs were superior to those obtained by the alkaline extraction and acid precipitation, with the protein prepared through DESs-dialysis demonstrating better water and oil holding capacities as well as emulsifying properties. This study will provide valuable data to support the expanded application of konjac protein in the food industry. -
魔芋是我国传统的药食两用植物，为天南星科魔芋属，富含多种化学营养成分，主要包括葡甘露聚糖、蛋白质、淀粉、生物碱和微量元素等[1]。在我国魔芋通常被加工成魔芋精粉以提高其经济价值，因魔芋精粉具有低热量、高膳食纤维、高强度与高粘度等特点，在食品生产中被广泛作为增稠剂、凝胶剂和稳定剂等食品添加剂来使用[2]。魔芋飞粉是魔芋精粉加工的主要废弃副产物，成分复杂多样，除含有生物碱及单宁多酚外，还富含淀粉多糖及蛋白质，但其食用化开发利用程度极低，常作废弃处理，造成了极大的资源浪费及环境污染[3−4]。
冲增哲等[5]研究表明，魔芋飞粉含粗蛋白27.3%，游离氨基酸2.25%，全氮素中至少有84.0%的成分是蛋白质和氨基酸，是一种潜在的植物蛋白资源。与动物蛋白食品相比，植物蛋白加工的食品往往含有更高水平的纤维和生物活性物质，并具有一定的降血脂血糖和抗氧化特性，将植物蛋白作为动物蛋白的替代品或补充剂近年来已引起了专家学者们的广泛关注[6]。赵姗姗等[7]在酶解魔芋飞粉制备高F值寡肽最佳工艺条件的研究中，采用pH9.0的Tris-HCl缓冲液浸提获得了魔芋飞粉中约85.0%的蛋白质。赵志峰等[8]采用超声辅助提取魔芋飞粉蛋白质，利用超声波空化作用破碎植物细胞、释放内容物，获得最佳工艺参数为：温度40 ℃，提取体系pH10.0，提取时间30 min，料液比1:30，超声频率为15 kHz，超声10 min。贺楠等[9]采用碱溶酸沉法提取魔芋飞粉蛋白质，最优提取条件为提取温度40 ℃、提取液pH10.0、提取时间40 min、料液比1:30，并测定过滤干燥的魔芋飞粉蛋白质的提取率为36.59%，蛋白质纯度为74.73%，且具有较好的乳化性能。周亚丽[10]采用碱溶酸沉法提取飞粉蛋白质制备魔芋ACE抑制肽，测得其等电点为pH3.8，蛋白纯度可达到54.89%。但整体来说，目前对于魔芋飞粉蛋白质的提取方法与其功能特性的研究仍开展得较少。
目前国内外有关植物蛋白提取分离工艺的研究及应用结果表明[11−12]，传统的碱溶酸沉提取工艺作为植物蛋白的经典制备方法，虽已实现工业化生产，但提取靶向性较低，产品感官及物化性能相对较差，尤其色深、味苦和溶解性差仍是其主要缺点。随着经济的快速发展，人们更加地追求高效且可持续性的绿色提取技术，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）因其具有溶解性高、提取率较高、成本低和可持续性等优点[13−14]，被作为一种新型环保型溶剂逐渐在植物组分提取中广泛应用。Cao等[15]将4种不同低共熔溶剂体系提取的芝麻蛋白与传统碱溶酸沉法提取的蛋白质相比，发现氯化胆碱-乙二醇体系提取的蛋白质纯度（93.3%）比碱溶酸沉（77.1%）高，其中氯化胆碱-草酸体系提取的蛋白质在溶解性、乳化性、起泡性和热稳定性方面表现良好。Karmi[16]等比较了4种DESs配方和两种碱性（pH12.0和pH9.0）处理剂从冷榨菜籽粕中提取蛋白的能力，结果表明4种DESs的提取效率均低于pH12.0（68.34%），但高于pH9.0（39.14%），DESs蛋白具有更好的发泡性能，并且与两种碱性处理相比，DESs可以更好地保留天然蛋白质结构。然而，目前关于使用DESs提取魔芋飞粉蛋白鲜有报道。
因此，本试验拟采用传统碱溶酸沉法、DESs-透析法和DESs-醇沉法3种不同方法制备魔芋飞粉蛋白质，进而对比3种魔芋飞粉蛋白质的结构及功能特性的差异，以期为魔芋飞粉蛋白质及其资源开发利用提供理论基础与数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
魔芋飞粉（含粗蛋白13.9%±0.3%，多糖40.4%±0.7%，水分8.0%±0.2%） 由湖北一致魔芋生物科技有限公司提供；蛋白预制胶 常州天地人和生物科技有限公司；5×蛋白上样缓冲液 北京库来博科技有限公司；氯化胆碱 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清蛋白 优级纯，赛国生物科技有限责任公司；其它化学试剂 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
A580型双光束紫外可见分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 平凡仪器责任有限公司；TGL-16A医用离心机 平凡科技有限公司；SB-5200DTD超声波清洗机 宁波新艺生物科技股份有限公司；JK9870A全自动凯氏定氮仪 济南精锐分析仪器有限公司；DYCZ-40D蛋白电泳仪 北京六一生物科技有限公司；TESCAN MIRA LMS场发射扫描电镜 捷克泰思肯（中国）有限公司；Nicolet 6700傅里叶红外光谱 美国赛默飞公司；TGA-1000C热重分析仪 上海盈诺精密仪器有限公司；QFN-DGJ-N冷冻干燥机 上海乔枫实业有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 魔芋飞粉蛋白质的制备
称取一定量的魔芋飞粉，分别采用碱溶酸沉法、DESs-透析法和DESs-醇沉法，得到3种不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质。
1.2.1.1 碱溶酸沉法
参考毛跟年等[17]的实验方法，将魔芋飞粉置于烧杯中，加入液料比为40:1（mL/g）的蒸馏水并搅拌均匀，用1.0 mol/L NaOH溶液调节至pH10.0，放入40 ℃恒温水浴锅中提取40 min，离心（4000 r/min，15 min）后再用1.0 mol/L HCl溶液将上清液pH调至等电点（pH3.8），静置30 min，再次离心后收集沉淀，用蒸馏水清洗沉淀3次后，合并沉淀，冷冻干燥后获得碱溶酸沉的魔芋飞粉蛋白质。
1.2.1.2 DESs-透析法
将魔芋飞粉置于烧杯中，加入体系含水量为20%的DESs氯化胆碱-尿素（1:1）（pH偏碱性），液料比为40:1（mL/g），在60 ℃下提取30 min，离心后取上清液[18]，通过3500 Da透析袋透析2 d，期间间隔换水，将所得透析液进行冷冻干燥后获得DESs-透析法的魔芋飞粉蛋白质。
1.2.1.3 DESs-醇沉法
将液料比为40:1（mL/g）的体系含水量为20%的DESs氯化胆碱-尿素（1:1）与魔芋飞粉混合（pH偏碱性），在60 ℃下提取30 min，离心后取上清液与其4倍体积的无水乙醇混合，以400 r/min搅拌5 min后，静置15 min后离心获得沉淀物，再加入蒸馏水洗涤后，将沉淀物合并后冷冻干燥，获得DESs-醇沉法的魔芋飞粉蛋白质。
1.2.2 蛋白质等电点的确定
称取5 g魔芋飞粉蛋白质于烧杯中，加入50 mL蒸馏水进行搅拌，用1.0 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，静置20 min，离心（4000 r/min，15 min）后取上清液，然后用1.0 mol/L的盐酸溶液将上清液pH分别调至3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2和4.4，离心后在595 nm处测定上清液中蛋白质含量，吸光度最低时所对应的pH即为魔芋飞粉蛋白质的等电点[17]。
1.2.3 蛋白质纯度测定
取3种不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质各0.1 g，采用凯氏定氮法测定样品中蛋白质的含量，测定方法参考GB 5009.5-2010。按式（1）计算蛋白质纯度。
(1) 1.2.4 魔芋飞粉蛋白质结构表征
1.2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳
参考Zhang等[19]的方法并按实际情况进行一定的改进。配制0.1 mg/mL魔芋飞粉蛋白质水溶液，离心后取清蛋白12 μL，加入3 μL的5×蛋白上样缓冲液（经改良后的以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的蛋白上样缓冲液）混合，沸水浴10 min破坏蛋白质三级结构，使用浓度为12%的分离胶和浓度为5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，上样量为5 μL，其电压为120 V，电泳时间为50 min。电泳结束后使用考马斯亮蓝染色法染色1 h，脱色液脱色数次至条带清晰后，使用凝胶成像仪扫描成像。
1.2.4.2 扫描电镜（SEM）分析
取少量不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质粉末均匀地涂抹在粘有导电胶的云母片上，固定在金属载台，并在样品表面喷一层黄金粉，在真空下将加速电压调至5 kV，进行SEM扫描。放大倍数为1000倍，观察魔芋飞粉蛋白质的微观结构[20]。
1.2.4.3 紫外-可见光光谱
参照张鑫[21]的测定方法，取1 mg/mL的魔芋飞粉蛋白质溶液稀释25倍后，于紫外可见光谱仪进行全波长扫描。
1.2.4.4 傅立叶红外光谱
取魔芋飞粉蛋白质粉末2 mg与溴化钾粉末混合压片，在4000~400 cm−1波数范围内进行透过率的扫描，使用OMNIC 9.2分析光谱数据，PeakFit v4.12对酰胺Ⅰ带进行蛋白质二级结构相对量计算[22]。
1.2.5 魔芋飞粉蛋白质功能特性
1.2.5.1 热稳定性
称取魔芋飞粉蛋白质样品10 mg于坩埚内，按下列测试条件进行测定：起始温度50 ℃，终止温度700 ℃，升温速率为10 ℃/min，整个实验进程充斥氮气。以氧化铝坩埚为参比，得到热重（TG）图谱，对其进行求导得到其微商热重分析（DTG）曲线[23]。
1.2.5.2 持水持油性
持水性测定参照宁伟伟[24]的测定方法并稍作修改，称取魔芋飞粉蛋白质样品0.5 g置于离心管中，再称量魔芋飞粉蛋白质与离心管的质量，于不同pH（pH2.0~10.0）条件下逐步加入不同浓度的氯化钠溶液（0~1.0 mol/L），搅拌样品至浆状不再析水，在不同温度条件（30~70 ℃）下静置，以6000 r/min的速度离心10 min，除去上清液，称量沉淀与离心管的质量。
持油性参照宋炜昱等[25]的测定方法并稍作修改，称取0.5 g魔芋飞粉蛋白质样品置于离心管中，加入3 mL食用调和油，搅拌后在不同温度（30~70 ℃）下静置，以6000 r/min的速度离心10 min，倒除残油，称量沉淀的质量，利用式（2）和（3）分别计算持水性（WA）和持油性（FA）。
(2) (3) 式中：m为魔芋飞粉蛋白质样品质量（g）；m1为离心管和蛋白样品的质量（g）；m2为离心管和沉淀物的质量（g）。
1.2.5.3 乳化及乳化稳定性
参考Zhang等[26]和贺楠[27]的方法进行测定并稍作修改。称取0.3 g魔芋飞粉蛋白质样品于离心管中，加入30 mL蒸馏水或已知浓度的氯化钠溶液（0~1.0 mol/L），配制成浓度为10 mg/mL蛋白溶液，调节pH（pH2.0~10.0），加入10 mL的食用调和油，在不同恒温（30~70 ℃）水浴锅中放置30 min后，高速均质2 min，将乳化液以6000 r/min的速度离心5 min，乳化性（EC）的计算如式（4）。继续将乳化样品于恒温水浴锅中水浴30 min，再冷却至室温，记录此时的乳化层高度，并计算其乳化稳定性（ES），如式（5）。
(4) (5) 1.2.5.4 起泡及起泡稳定性
参照岐婉等[28]的方法并稍作修改，分别取0.1 g不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质样品，加入已知浓度的NaCl溶液（0~1.0 mol/L）或者蒸馏水，配制得到浓度为10 mg/mL的魔芋飞粉蛋白质溶液，将溶液放于50 mL离心管中，调节pH（pH2.0~10.0），在不同恒温（30~70 ℃）水浴锅中放置15 min后匀浆3 min，测定此时泡沫体积，按照式（6）计算其起泡性（FC）。静置30 min后观察此时泡沫体积，按照式（7）计算其泡沫稳定性（FS）。
(6) (7) 式中：V为初始溶液体积（mL）；V0为匀浆后0 min的泡沫体积（mL）；V30为静置30 min后的泡沫体积（mL）。
1.3 数据处理
所有实验重复至少三次，结果以平均值±标准差表示，采用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据分析，P<0.05为显著性差异。图表使用OriginPro 2021软件及Excel进行绘制。
2. 结果与分析
2.1 魔芋飞粉蛋白质等电点确定
由图1可知，碱溶酸沉法制备的魔芋飞粉蛋白质的吸光度随pH的增加先下降后上升，在pH3.8时吸光度显著降低（P<0.05）。由于蛋白质的溶解性在等电点处最小，因此选择pH3.8为魔芋飞粉蛋白质的最佳等电点，此结果与毛跟年等[17]的实验结果一致。
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图 1 魔芋飞粉蛋白质的等电点注：不同小写字母表示显著差异（P<0.05），图2同。Figure 1. The isoelectric point of konjac fly flour protein2.2 不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质纯度的影响
考察了不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质纯度的影响。由图2所示，3种方法制备的蛋白质纯度大小依次为：DESs-醇沉法>DESs-透析法>碱溶酸沉法。其中，DESs-醇沉法制备的蛋白质纯度显著高于其它2种方法（P<0.05），为85.3%±0.8%。
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图 2 不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质纯度的影响Figure 2. Effects of different preparation methods on protein purity of konjac fly powder2.3 不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质结构的影响
2.3.1 SDS-PAGE和SEM分析
SDS-PAGE通常用于蛋白质分子量和亚基组成分析。不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质的SDS-PAGE结果如图3a所示，主要由低分子量亚基组成，分布在三个区域：10~17 kDa，17~26 kDa和43~55 kDa，与贺楠[27]的测定结果基本一致。此外，不同方法制备的蛋白质分子质量组成并没有出现明显的差异。
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图 3 不同魔芋飞粉蛋白质的SDS-PAGE和SEM图注：（a）SDS-PAGE图，（b）碱溶酸沉、（c）DESs-透析和（d）DESs-醇沉SEM图。Figure 3. SDS-PAGE and SEM images of different konjac fly powder proteins扫描电镜可以显示蛋白质的微观结构和表面形貌。三种不同方法制备的蛋白质的SEM结果如图3b~d所示。可以看出，碱溶酸沉法下得到的蛋白质相较于DESs-透析法和DESs-醇沉法所得蛋白质结构更加紧密，表面虽较为光滑但仍存在凸起点，有明显断裂现象（图3b）；经过DESs-透析法得到的蛋白质结构疏松，表面平整，有着较为分布均匀的孔洞结构（图3c）；而DESs-醇沉法得到的蛋白质则表面粗糙且存在断裂现象，孔洞大小不一且分布不均匀（图3d）。这些现象表明无论在提取还是分离过程中，不同化学物质的使用对蛋白质结构的破坏作用也不同，最终导致形成不同的形态。
2.3.2 紫外与红外光谱分析
2.3.2.1 紫外与红外光谱图分析
不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质的紫外可见光谱图，如图4a所示。三种蛋白质均在210~250 nm左右处有强吸收峰，说明魔芋飞粉蛋白质是含有两个双键的共轭体系可能是共轭二烯或者α，β-不饱和羧基化合物等[29]。与碱溶酸沉法相比，DESs提取的两种蛋白吸收峰稍向左偏移，但峰形并未改变，这可能是因为DESs的使用影响使其吸收波向短波方向移动，但DESs未与魔芋飞粉蛋白质产生新的化学键[30]，蛋白质构象不变。
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图 4 不同魔芋飞粉蛋白质的紫外与红外光谱图注：（a）紫外可见光谱图，（b）红外光谱图。Figure 4. Ultraviolet and infrared spectra of different konjac fly powder proteins不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质的红外光谱图，如图4b所示。结果表明，碱溶酸沉法、DESs-透析法和DESs-醇沉法制得的蛋白质分别在3304.1 cm−1、3355.6 cm−1、3426.5 cm−1附近出现强烈震动带，说明魔芋飞粉蛋白质中存在N-H伸缩振动，当其基团与H键相接触后，开始向低频转移。3种飞粉蛋白质均在2850~3000 cm−1处出现特征峰，为C-H键的伸缩振动峰，DESs提取的2种飞粉蛋白相对碱溶酸沉蛋白的特征峰发生了偏移，这可能是因为DESs通过氢键和疏水键与飞粉蛋白作用，从而发生偏移[31]。酰胺Ⅰ带通常位于1600~1700 cm−1之间，主要由于C=O键的伸缩振动而产生吸收峰[32]，反映了蛋白质主要的二级结构变化；如图4b所示，碱溶酸沉蛋白酰胺Ⅰ带在1647.9 cm−1处，相比之下，DESs的2种蛋白分别偏移至1650.1 cm−1和1667.3 cm−1。酰胺Ⅱ带1480~1580 cm−1与vN-H伸缩振动及δN-H弯曲振动有关，DESs的2种蛋白均发生轻微偏移；酰胺Ⅲ带1200~1350 cm−1由于C-N拉伸产生吸收峰[33]；而1027 cm−1附近主要是C-O-C伸缩振动产生振动峰。
2.3.2.2 二级结构分析
在酰胺Ⅰ带测定3种飞粉蛋白的二级结构β-折叠（1600~1640 cm−1），无规则卷曲（1640~1650 cm−1），α-螺旋（1650~1660 cm−1），β-转角（1660~1700 cm−1）的相对含量[22]。结果如表1所示，DESs-透析蛋白（10.9%）的β-折叠比DESs-醇沉法（38.4%）和碱溶酸沉法（29.7%）更低；但DESs-透析所获的飞粉蛋白（40.0%）的无规则卷曲比碱溶酸沉法（24.5%）更高，且DESs-醇沉蛋白没有无规则卷曲出现；碱溶酸沉法所获飞粉蛋白的α-螺旋为22.8%，但DESs所获的2种蛋白均无α-螺旋；与碱溶酸沉法（23.0%）相比DESs-透析法（49.1%）和DESs-醇沉法（61.6%）所获飞粉蛋白的β-转角显著更高（P<0.05）。这些结果表明，不同的制备方法可能导致飞粉蛋白的二级结构相对含量发生变化，这可能是由于碱溶液和DESs提取飞粉蛋白的溶解性以及分离方式的不同而产生的结果[34]。蛋白质的碱溶液提取主要是在静电斥力下，通过疏水相互作用促进疏水基团的暴露和蛋白质聚集[35]；而DESs提取主要是与蛋白质氨基或羧基之间形成氢键，不同DESs的结合氨基酸不同。
表 1 不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质二级结构相对含量Table 1. Relative content of protein secondary structure of konjac fly powder with different preparation methods样品 β-折叠（%） 无规则卷曲（%） α-螺旋（%） β-转角（%） 碱溶酸沉 29.7±0.2b 24.5±0.2b 22.8±0.1 23.0±0.2c DESs-透析 10.9±0.2c 40.0±0.2a / 49.1±0.1b DESs-醇沉 38.4±0.2a / / 61.6±0.2a 注：同列不同小写字母表示显著差异（P<0.05）。 2.4 不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质功能特性的影响
2.4.1 热稳定性分析
三种方法所得魔芋飞粉蛋白质的TG（黑色）和DTG（灰色）曲线，如图5所示。所有样品的DTG分析曲线大致可以分为两个阶段，第一阶段（50~200 ℃左右）的起始温度T≈50 ℃，随着温度的上升样品重量缓慢减少，碱溶酸沉法、DESs-透析法和DESs-醇沉法所获飞粉蛋白质分别在69 ℃、92 ℃和90 ℃出现峰值，此阶段重量变化的主要原因是样品中的水分蒸发[36]，且使蛋白质结构开始变得不稳定。第二阶段（201~550 ℃左右），随着温度的继续上升，样品的质量骤然下降，在T≈300 ℃左右时出现第二个峰值，蛋白质开始热降解，蛋白质中肽键迅速脱水，C=O、C-N、C-O键断裂[37]。此外，当第二阶段温度T≈450 ℃时，碱溶酸沉法制备的蛋白质（图a）质量变化速率显著高于DESs法提取的2种蛋白质（图b~c）。由DESs提取的蛋白质的峰值温度（316 ℃和312 ℃）高于碱溶酸沉法的蛋白质（304 ℃）可知，DESs提取的蛋白质比传统碱溶酸沉法制备的蛋白质热稳定性更高。
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图 5 不同魔芋飞粉蛋白质的TGA热重分析图注：（a）碱溶酸沉，（b）DESs-透析，（c）DESs-醇沉。Figure 5. TGA thermogravimetric analysis of different konjac fly flour proteins2.4.2 持水持油性
蛋白质持水持油性是检验蛋白质与水或油结合能力强弱的重要指标[38]。不同NaCl浓度对不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质持水性的影响，如图6a所示。在pH7.0、温度为40 ℃条件下，随着NaCl浓度的升高三种蛋白质的持水性均呈现先增大后减小的趋势。当NaCl浓度达到0.6 mol/L时，DESs-透析法和碱溶酸沉法所得蛋白质的持水性最高，而DESs-醇沉法蛋白在0.8 mol/L获得最高持水性。此外，DESs提取的蛋白质持水性显著高于碱溶酸沉法制备的蛋白质（P<0.05），其中透析得到的蛋白质持水性最佳，在NaCl浓度为0.6 mol/L时持水性达到最大289.5%±2.9%，这可能是因为DESs所提取的蛋白质中清蛋白极性氨基酸残基与水分子作用较强而引起[39]。蛋白质的持水性在低盐浓度时随其浓度的增大而增大，但盐浓度过高时，会导致盐离子与水的结合作用力远超过水与蛋白质的结合作用力，从而使蛋白质脱水变性，持水性降低[40]。
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不同pH对不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质持水性的影响，如图6b所示。在温度为40 ℃时，不同pH对三种方法制备的蛋白质的pH-持水性曲线基本符合“V”字形曲线，最低点接近魔芋飞粉蛋白质等电点（pH3.8），此时三种蛋白质持水性分别为：46.3%±10.9%（碱溶酸沉法）、68.6%±10.8%（DESs-透析法）和109.3%±11.0%（DESs-醇沉法），这是因为在等电点附近蛋白质与水分子的结合能力在此时最低。pH小于其等电点时，持水性均随pH增加而降低；而pH大于等电点时，持水性随着pH的增加而增加，最后趋近于平缓。其中由DESs所提取的蛋白质持水性基本上都高于碱溶酸沉法制得的蛋白质，透析所得蛋白质的持水性最佳。
不同温度对不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质持水性的影响，如图6c所示。在pH7.0时，随着温度的升高三种蛋白质的持水性均呈现先上升后下降的趋势。当温度为60 ℃时，三种蛋白质持水性均达到最大，持水性大小依次为：DESs-透析法>DESs-醇沉法>碱溶酸沉法，这可能是因为在一定温度范围内，与碱溶酸沉法所提蛋白相比，DESs更有助于飞粉蛋白溶解形成网络结构捕获水分子，从而使飞粉蛋白的持水性更好[15]。在低温范围中，温度的升高使分子的热运动加快，促进蛋白质分子与水分子的结合，增加其持水性；但当温度升高后，高温导致蛋白质变性及空间构象改变，从而降低了持水性。
不同温度对不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质持油性的影响，如图6d所示。当温度从30 ℃升至40 ℃时，DESs提取的蛋白质的持油性也随之升高，最大值分别为145.4%±4.6%（DESs-透析法）和143.2%±5.3%（DESs-醇沉）；而当温度继续上升后，持油性开始有不同程度的下降。而当温度为50 ℃时，碱溶酸沉法的最大持油性为129.3%±6.3%。这是因为脂质与蛋白质分子间的疏水相互作用，在一定温度范围内，随着温度的升高在其强作用下会产生蛋白质-脂质络合物；但温度过高后，会导致脂质的粘度降低，其持油性下降[41−42]。
2.4.3 乳化及乳化稳定性
在pH7.0、温度为40 ℃的条件下，不同NaCl浓度对魔芋飞粉蛋白质乳化及乳化稳定性的影响如图7a和d所示。三种蛋白质的乳化性和乳化稳定性均随浓度的增大而呈先增大后减小的趋势，然而它们的最大值在不同NaCl浓度下获得。例如，当NaCl浓度为0.8 mol/L时，DESs-透析法所得的蛋白质乳化性（50.3%）及乳化稳定性（59.2%）达到最高；而DESs-醇沉法（42.9%±3.6%和51.6%±1.6%）和碱溶酸沉法（36.2%±3.3%和35.6%±1.0%）所得蛋白质的乳化性及乳化稳定性在NaCl浓度为0.4 mol/L或0.6 mol/L时获得最大值。这是因为在一定低盐离子浓度范围内，蛋白分子间因电荷作用而斥力减弱，当氯化钠浓度超出一定值，胶体的扩散双电层被盐离子压制，静电复合物的形成被破坏，导致乳化能力减弱[24]。
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图 7 不同魔芋飞粉蛋白质的乳化及乳化稳定性分析图Figure 7. Analysis diagram of emulsification and emulsification stability of different konjac fly flour proteins当温度为40 ℃时，不同pH对魔芋飞粉蛋白质乳化及乳化稳定性的影响，如图7b和e所示。靠近等电点时蛋白质溶解度最小，不能在蛋白表面形成水化层，促使乳化粒子絮集[43]，因此在pH3.8附近三种蛋白质的乳化稳定性和乳化性都较差。其中碱溶酸沉法的乳化性和乳化稳定性最差分别为23.5%±0.4%和26.4%±2.8%。远离等电点时，乳化性、乳化稳定性都出现升高，这是由于魔芋飞粉蛋白质的溶解性有所提高，增大了蛋白质向O/W界面的扩散能力，使乳化的能力而所有提升；但pH过高时，又会导致蛋白质的乳化稳定性下降（图7e）。DESs提取的蛋白质中可能因为清蛋白含量更高，清蛋白的乳化能力及乳化稳定性最好[44]，蛋白质内部更多的疏水基团露在分子表面时，产生有利于乳状液稳定性的静电斥力，表现出更好的乳化能力和乳化稳定性[45−46]。
在pH7.0条件下，不同温度对魔芋飞粉蛋白质乳化及乳化稳定性的影响，如图7c和f所示。当温度较低时（30~50 ℃），低温促使蛋白质分子易被吸附在油水界面上，随着温度的增加，3种蛋白质的乳化性及其稳定性随之增加；但温度过高后，蛋白质理化性质发生改变，如硬度和黏度都有所下降，且乳化颗粒粒子的运动能力在高温下得到增强，同时让蛋白质的凝胶作用有所改变，最终导致乳化性和稳定性下降；而在温度为50 ℃时，三种蛋白质的乳化性和乳化稳定性均相对较好。
2.4.4 起泡及起泡稳定性
在pH7.0、温度为40 ℃的条件下，不同NaCl浓度对魔芋飞粉蛋白质起泡及起泡稳定性的影响如图8a和d所示。在一定NaCl浓度范围（0~1.0 mol/L）内，三种蛋白质的起泡性和起泡稳定性均随NaCl浓度的上升而呈现先上升后下降的趋势，这可能是起泡性和起泡稳定性在低离子浓度下因蛋白质溶解度的提高而有所改善，从而有助于在泡沫系统中气泡周围形成内聚的蛋白质膜，但是当离子浓度过大时，NaCl反而使蛋白质的粘度降低，从而导致起泡性及起泡稳定性下降[47]。其中DESs-透析法在NaCl浓度为0.8 mol/L时起泡性及其稳定性最优，分别为58.0%±2.0%和59.2%±0.8%，其原因可能是因为经过DESs-透析法提取的魔芋飞粉蛋白质分子聚集程度降低，从而使得蛋白质的柔韧性发生改变，使蛋白质更容易吸附在气-水界面上[48]，进而增加了其起泡性；Yuliana等[49]研究发现NaCl的加入，可以使得粘附倾向在蛋白质分子之间形成，同时界面蛋白质层也会产生，从而维护了泡沫的完整性；但因为盐析反应的存在，进一步增加NaC1浓度反而对起泡性和起泡稳定性产生了反效果。
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图 8 不同魔芋飞粉蛋白质的起泡及起泡稳定性分析图Figure 8. Analysis diagram of foaming and foaming stability of different konjac fly flour proteins当温度为40 ℃时，不同pH对魔芋飞粉蛋白质起泡及起泡稳定性的影响，如图8b和e所示。3种蛋白质的起泡性均在等电点附近较差，而起泡稳定性与起泡性曲线的趋势完全相反，这是因为当pH靠近等电点时，泡沫量较少，界面的不溶性颗粒增大了蛋白膜厚度及黏性[50]，故而增加了泡沫稳定性。
当pH7.0时，不同温度对魔芋飞粉蛋白质起泡及起泡稳定性的影响，如图8c和f所示。在一定温度范围内（30~70 ℃），随着温度的升高，3种蛋白质的起泡性及其稳定性均呈现先升高后下降的趋势；DESs-透析法得到的蛋白质起泡性（57.7%±0.9%）和泡沫稳定性（57.0%±1.4%）分别在60 ℃和40 ℃时呈现最大值。起泡及起泡稳定性获得最大值后继续升温会导致蛋白质聚集沉淀、疏水性增大、相互作用减弱[51]，从而使得3种飞粉蛋白的起泡性及稳定性不增反降。
3. 结论
本研究采用碱溶酸沉、DESs-透析和DESs-醇沉三种方法制备魔芋飞粉蛋白质，并对比3种蛋白质的结构和功能特性差异。与传统的碱溶酸沉法相比，DESs提取的蛋白质纯度更高。SDS-PAGE结果显示魔芋飞粉蛋白质的分子量相对较小，主要由10~55 kDa低分子量亚基组成。通过SEM、UV-Vis和FT-IR观察到，碱溶酸沉法与DESs提取的飞粉蛋白质在微观结构和二级结构上存在一定差异，且DESs提取的飞粉蛋白β-转角相对含量比碱溶酸沉显著更高（P<0.05），但无α-螺旋。热重分析曲线表明3种不同方法制备的飞粉蛋白质均在300 ℃左右时开始出现热降解现象，且DESs法提取的蛋白质的峰值温度均比碱溶酸沉（304 ℃）高，其中DESs-透析的蛋白（316 ℃）的热稳定性最佳。此外，我们还发现3种飞粉蛋白的持水持油性、乳化和起泡性能在不同NaCl浓度（0~1.0 mol/L）和温度（30~70 ℃）条件下均呈先上升后下降的趋势，且在等电点pH3.8附近功能特性最差。在不同测试条件下DESs提取的蛋白质功能特性显著优于碱溶酸沉法，其中DESs-透析的蛋白质具有更好的持水持油性和乳化性能。本研究系统地比较了不同制备方法对飞粉蛋白质结构和功能特性的影响，后续将进一步优化飞粉蛋白的制备工艺，并结合其结构与功能特性开发相关食品，为魔芋飞粉在食品工业的应用提供理论依据。
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图 1 魔芋飞粉蛋白质的等电点
注：不同小写字母表示显著差异（P<0.05），图2同。
Figure 1. The isoelectric point of konjac fly flour protein
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图 2 不同制备方法对魔芋飞粉蛋白质纯度的影响
Figure 2. Effects of different preparation methods on protein purity of konjac fly powder
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图 3 不同魔芋飞粉蛋白质的SDS-PAGE和SEM图
注：（a）SDS-PAGE图，（b）碱溶酸沉、（c）DESs-透析和（d）DESs-醇沉SEM图。
Figure 3. SDS-PAGE and SEM images of different konjac fly powder proteins
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图 4 不同魔芋飞粉蛋白质的紫外与红外光谱图
注：（a）紫外可见光谱图，（b）红外光谱图。
Figure 4. Ultraviolet and infrared spectra of different konjac fly powder proteins
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图 5 不同魔芋飞粉蛋白质的TGA热重分析图
注：（a）碱溶酸沉，（b）DESs-透析，（c）DESs-醇沉。
Figure 5. TGA thermogravimetric analysis of different konjac fly flour proteins
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图 7 不同魔芋飞粉蛋白质的乳化及乳化稳定性分析图
Figure 7. Analysis diagram of emulsification and emulsification stability of different konjac fly flour proteins
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图 8 不同魔芋飞粉蛋白质的起泡及起泡稳定性分析图
Figure 8. Analysis diagram of foaming and foaming stability of different konjac fly flour proteins
表 1 不同方法制备的魔芋飞粉蛋白质二级结构相对含量
Table 1 Relative content of protein secondary structure of konjac fly powder with different preparation methods
样品 β-折叠（%） 无规则卷曲（%） α-螺旋（%） β-转角（%） 碱溶酸沉 29.7±0.2b 24.5±0.2b 22.8±0.1 23.0±0.2c DESs-透析 10.9±0.2c 40.0±0.2a / 49.1±0.1b DESs-醇沉 38.4±0.2a / / 61.6±0.2a 注：同列不同小写字母表示显著差异（P<0.05）。 
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