Correlation Analysis between Bacterial Taxa and Physicochemical Indexes of High-temperature Daqu in Lanling Wine
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摘要: 为分析山东临沂地区高温大曲细菌类群及其理化特性，本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术和纯培养技术对兰陵酒业高温大曲中细菌类群进行了解析，通过常规检测方法对其理化指标进行了测定，探究大曲中细菌类群与理化指标之间的关联性。结果表明，大曲中细菌属主要为克罗彭斯特德菌属（Kroppenstedtia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、红球菌属（Rhodococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）和芽孢杆菌属（Bacillus）等。Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus coagulans为可培养优势细菌分离株。15份高温大曲间糖化力、酯化力、酒化力和液化力差异较大。Kroppenstedtia、Staphylococcus、Leucobacter、Rhodococcus和Weissella与酯化力、发酵力、酒化力、酯化力和液化力间呈现显著相关性（P<0.05）。由此可见，兰陵酒业高温大曲中存在大量核心细菌类群，且各细菌属与理化指标间存在明显相关性，进一步为该地区高温大曲品质的改善与提升提供参考。Abstract: In order to analyze the high-temperature Daqu bacterial taxa and their physicochemical properties in Linyi area, Shandong Province, Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology and pure culture technology were used to analyze the bacterial taxa of high-temperature Daqu in Lanling wine, and then the physicochemical indexes were determined by conventional detection methods in this study. Finally, the correlation between bacterial taxa and physicochemical indexes in Daqu was explored. The results showed that the main genera of bacteria in Daqu were Kroppenstedtia, Thermoactinomyces, Saccharopolyspora, Staphylococcus, Rhodococcus, Weissella and Bacillus, et al. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans were cultureable dominant bacterial isolates. There was a large difference in saccharification, esterification, alcoholization and liquefaction between the 15 parts of high-temperature Daqu. Kroppenstedtia, Staphylococcus, Leucobacter, Rhodococcus and Weissella were significantly positively correlated with esterification, fermentation, alcoholization, esterification and liquefaction (P<0.05). Thus, there are a large number of core bacterial taxa in high-temperature Daqu in Lanling wine, and there is a significant correlation between various bacterial genera and physicochemical indexes, which further provides a reference for the improvement and enhancement of the quality of high-temperature Daqu in this area.
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高温大曲作为酱香型白酒重要的发酵剂和糖化剂，其以小麦、大麦和豌豆为主要原料，经定型、发酵和成熟而成，含有丰富的微生物和各种酶类，是酱香型白酒酿造过程中的内在驱动力[1]。高温大曲在制曲发酵过程中，由于曲室原有位置的温度、湿度和氧浓度等环境因素差异导致大曲内部发生不同程度褐变，根据颜色一般分为黑色、白色和黄色三种大曲[2]。在特殊高温发酵环境下，大曲内部微生物群落结构的演替和酶系的有效富集均会被实现，从而达到原料降解和代谢发酵的功能[3]。且随着发酵温度的升高，大部分不耐高温的酵母菌和霉菌逐渐消亡，大曲内部微生物以细菌为主开始繁殖，并形成了独特的微生物群落结构[4]。因此，积极开展对高温大曲中细菌群落多样性的研究，是充分认识其酿造微生物资源和提高产品品质的前提和基础。
近年来，以MiSeq为代表的第二代高通量测序技术不仅被广泛应用于分析各种白酒大曲的微生物群落结构，还被用于揭示微生物群落与大曲品质的关系，且与传统纯培养技术相比该技术可准确检测出难以培养、丰度较低和休眠状态下的微生物[5]。例如，CAI等[6]使用高通量测序技术和电子感官技术对低温大曲的微生物多样性和品质特征进行了全面研究，发现细菌主要影响大曲滋味品质，而真菌主要影响大曲风味品质。何猛超等[7]采用高通量测序技术对贵州茅台地区高温大曲的细菌群落结构进行了解析，发现细菌属主要为高温放线菌属（Thermoactinomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）和乳杆菌属（Lactobacillus）。WANG等[8]采用同样的方法对湖北襄阳地区高温大曲的细菌群落结构进行了解析，发现主要细菌属为Thermoactinomyces、葡萄球菌属（Staphylococcus）、慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）、Bacillus、克罗彭斯特德菌属（Kroppenstedtia）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）等。由此可见，虽然不同地区高温大曲中细菌类群均以嗜热细菌属为主，但其菌群种类存在明显差异，因而增加高温大曲的采集来源并积极探索其内部细菌类群的结构特征是极为必要的。除此之外，理化指标亦为反映大曲品质的重要参数。LIU等[9]的研究表明，微生物的代谢活动会影响大曲的理化性质，进而影响大曲的功能表现和白酒风味形成。因此，积极开展对高温大曲中微生物群落与各理化指标之间的关联性研究对白酒生产具有重要意义。
黄淮流域产区是中国酿造白酒核心产区之一，横跨河南、江苏、山东和安徽四省。其中，兰陵酒业位于山东省临沂市，该地区地处鲁中南低山丘陵区东南部和鲁东丘陵南部，四季分明，雨量充沛且雨热同季，属温带季风区大陆性气候，该地区可能蕴含了较为丰富的酿酒微生物资源，然而目前针对该地区高温大曲微生物多样性的研究尚少，且微生物群落与大曲理化指标间的关系尚不明确。因此，本研究以兰陵酒业高温大曲为研究对象，采用Illumina MiSeq高通量测序技术和纯培养技术对大曲内部细菌类群结构进行解析，同时使用常规检测方法对其理化指标进行测定，继而揭示大曲中细菌类群与理化指标间的关联性，以期为后续临沂地区酿酒微生物资源的挖掘和大曲品质变化的机理提供理论依据和数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
高温大曲 采集自山东省临沂市（E117°24’~119°11’，N34°22’~36°13’）兰陵酒业制曲车间，从同一批次、同一曲房和同一班组中曲堆不同位置随机选取黄色成品曲共15份，编号为LL1~LL15，运送至实验室后及时粉碎并于−20 ℃下保存。大曲以纯小麦为生产原料，加入深井水对其进行润料再辊磨粉碎，粉碎后二次加入深井水进行拌料，拌料均匀后输送到压曲机制作曲坯，待曲坯成型后立即入房排列进行卧曲，再于65 ℃条件下发酵培养40 d，曲坯培养至曲心水分基本全部蒸发，品温降至接近室温时，曲已培养成熟，即可将曲块出房入库；营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；宏基因组DNA提取试剂盒 德国QIAGEN公司；dNTP缓冲液、rTaq酶、DNA聚合酶、pMD18-T载体 大连宝生物工程有限公司；Axygen清洁试剂盒 康宁生命科学吴江有限公司；引物338F/806R、27F/1495R、M13F（-47）/M13R（-48） 上海桑尼生物科技有限公司；MiSeq测序配套试剂 美国Illumina公司；其他试剂均为国产分析纯。
LRH-250生化恒温培养箱 上海力辰仪器科技有限公司；Veriti梯度基因扩增仪 美国ABI公司；DYY-12电泳仪 北京六一仪器厂；UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国ProteinSimple公司；Illunima MiSeq PE300高通量测序平台 美国Illumina公司；R920机架式服务器 美国Dell公司。
1.2 实验方法
1.2.1 宏基因组DNA提取、PCR扩增及高通量测序
准确称取3.0 g高温大曲样品于8 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中充分振荡，经800 r/min离心10 min后，取上清液13000 r/min继续离心10 min并收集菌体，使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒对高温大曲细菌的宏基因组DNA进行提取。将提取的DNA存放于−20 ℃冰箱中备用。参照WANG等[8]的方法，使用正反向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA V3~V4区基因序列进行PCR扩增，其中扩增条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 7 min。使用1%的琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计对PCR产物进行检测，将OD260/OD280在1.8~2.0之间的PCR产物稀释至100 nmol/L后寄送至上海美吉生物医药科技有限公司的MiSeq高通量测序平台完成双末端测序。
1.2.2 生物信息学分析
本研究使用QIIME（v1.9.0）平台进行生物信息学分析。首先将测序返回的序列进行拼接并参照CAI等[6]的质控条件对其进行高质量筛选，利用PyNAST对序列进行校准，继而使用UCLUST根据97%相似度构建分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）[10]，使用ChimeraSlayer去除嵌合体后，从每个OTU中选取具有代表性的序列在各数据库[11−13]中进行比对以确定其分类学地位。
1.2.3 高温大曲中细菌的分离鉴定
使用0.85%浓度的生理盐水对高温大曲中细菌进行倍比稀释，取10−4和10−5梯度稀释液涂布于NA琼脂培养基上，于30 ℃生化培养箱中倒置培养36 h，继而采用平板划线法对细菌菌株进行纯化并于−80 ℃下甘油保藏备用。参照倪慧等[14]的方法采用CTAB法对分离菌株进行DNA的提取，并以其为模板使用扩增引物27F/1495R进行PCR扩增，继而使用Axygen PCR清洁试剂盒进行清洗，并进一步对其进行连接转化后挑取阳性克隆子送往上海赛恒生物科技有限公司进行测序，将返回的序列在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上与模式菌株进行比对进而明确其分类地位。
1.2.4 高温大曲理化指标的测定
大曲酸度、水分、氨基酸态氮、灰分、淀粉含量、糖化力、酯化力、发酵力、酒化力和液化力的测定方法具体参照QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》。使用凯氏定氮法测定大曲中蛋白质含量[15]，大致步骤为：精确称取曲粉样品0.2 g（精确到0.1 mg）于消化管中，继续加入0.2 g硫酸铜、3 g硫酸钾和浓硫酸8.0 mL进行充分混合并消化，同时准备空白试样，其中消化模式为直线升温式，条件为420 ℃维持90 min，待消化完成后将消化管取出，冷却至室温，继而在全自动凯氏定氮仪上进行测定。
1.3 数据处理
使用R（v4.1.3）软件绘制箱型图、气泡图、瀑布图和相关性热图，使用MEGA 7.0软件绘制系统发育树，使用Excel 2010绘制复合饼图，基于在线网站（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）绘制Venn图。
2. 结果与分析
2.1 高温大曲细菌类群α多样性分析
本研究参照GB 4789.2-2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》对高温大曲细菌菌落总数进行了计数，发现其总数范围在6.51~7.19 lg CFU/g。基于此，本研究进一步采用MiSeq高通量测序技术对高温大曲中细菌类群进行了解析，发现从15份高温大曲中共获得862353条高质量16S rRNA序列，平均每份大曲样品57490条，经97%相似度划分后共得到37426个OTU。高温大曲细菌类群的α多样性结果如图1所示。
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图 1 高温大曲中细菌物种累积箱型图Figure 1. Box diagram of bacterial species accumulation in high-temperature Daqu由图1可知，随着大曲样品数量的增加，虽然物种累积曲线一直持续上升，但其上升幅度在逐渐减小，且于第15个样品中增加的物种数几乎为零，这表明纳入本研究的样品几乎涵盖了大曲中所有细菌物种。由此可见，本研究的样品量和测序深度均满足后续分析的要求。
2.2 高温大曲细菌类群结构分析
纳入本研究的所有大曲中平均相对含量>1.0%的细菌门和属被定义为优势细菌门和属，平均相对含量<1.0%的细菌门和属归为“Others”。经序列比对分析，15份高温大曲共鉴定到13个门、29个纲、54个目、120个科和224个属。为明确兰陵酒业高温大曲中细菌类群结构特征，本研究对其平均相对含量>1.0%的细菌门和属组成情况进行了解析，其气泡图如图2所示。
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图 2 平均相对含量>1.0%的细菌门（A）和细菌属（B）分布Figure 2. Distribution of bacterial phylum (A) and genus (B) with an average relative abundance of >1.0%由图2A可知，在门水平上，纳入本研究的高温大曲中存在3个优势细菌门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），其平均相对含量分别为62.02%、24.39%和11.48%。由图2B可知，在属水平上，纳入本研究的高温大曲中存在11个优势细菌属，分别为Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Staphylococcus、红球菌属（Rhodococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、Bacillus、代尔夫特菌属（Delftia）、乳球菌属（Lactococcus）、亮杆菌属（Leucobacter）和肠球菌属（Enterococcus），其平均相对含量分别为21.81%、18.21%、14.35%、7.34%、5.76%、3.30%、3.22%、3.01%、2.22%、1.62%和1.14%。
将所有大曲中均存在的OTU定义为核心OTU，本研究进一步在OTU水平上分析了高温大曲的细菌类群结构，结果如图3所示。
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图 3 基于OTU水平的Venn图（A）和平均相对含量>1.0%的核心OTU瀑布图（B）Figure 3. Venn plot based on OTU level (A) and waterfall plot of core OTU with an average relative abundance of >1.0% (B)由图3A可知，纳入本研究的15份高温大曲中核心OTU有173个，包含了571999条序列，占高质量序列数的66.33%。由图3B可知，平均相对含量>1.0%的核心OTU仅有15个，占核心OTU总数的8.67%。其中，有3个核心OTU隶属于Thermoactinomyces，分别为OTU31065、OTU938和OTU2367，累积平均相对含量为13.24%。另有3个隶属于Kroppenstedtia，分别为OTU10073、OTU35053和OTU14953，累积平均相对含量为11.21%。有2个隶属于Saccharopolyspora，分别为OTU3416和OTU29126，累积平均相对含量为7.91%。另有2个隶属于肠杆菌目（Enterobacteriaceae），分别为OTU8432和OTU15743，累积平均相对含量为4.12%。各有1 个隶属于Staphylococcus、Rhodococcus、Weissella、Delftia和Lactococcus，分别为OTU19300、OTU16440、OTU7520、OTU14207和OTU36065，其平均相对含量分别为5.88%、4.73%、2.59%、2.02%和1.39%。由此可见，兰陵酒业高温大曲中存在大量核心细菌类群，且主要由Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Staphylococcus、Rhodococcus、Weissella、Delftia和Lactococcus组成。
孙羊羊等[16]对天津地区高温大曲微生物类群进行分析发现，海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、Kroppenstedtia、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）、Bacillus、Staphylococcus和Saccharopolyspora为其优势细菌属。何猛超等[17]对湖南地区高温大曲细菌类群进行分析发现，Bacillus、Lactococcus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、假诺卡氏菌属（Pseudonocardiaceae）、片球菌属（Pediococcus）、Thermoactinomyces、和Weissella为优势菌属。GAN等[18]对贵州地区高温大曲微生物类群进行分析发现，链孢杆菌属（Desmospora）、Bacillus、乳酸菌属（Lactobacillus）、Saccharopolyspora和Virgibacillus等为优势细菌属。由此可见，不同地区高温大曲中细菌类群丰富且存在差异，但各地区在优势细菌属的菌群结构组成上具有高度相似性。
高温大曲在制曲发酵过程中温度可达60~70 ℃，Kroppenstedtia和Thermoactinomyces均属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae），在高温高湿的环境下生长旺盛，且适当的高温度和高湿度均有助于大曲内部发生美拉德反应和焦糖化反应，形成大量黑色或深棕色化合物[19]，亦有研究表明，控制翻动时间会影响大曲内部温度与含水量，从而影响大曲的颜色[20]。GAN等[18]的研究表明，酱香型白酒在生产过程中，Saccharopolyspora为产生风味物质所必需的菌属。WANG等[8]的研究表明，Staphylococcus可能更多来源于制曲周围环境中，该菌属不仅具有代谢2,3-丁二醇的潜力，还具有产脂肪酶的能力，同时，Delftia为产生愈创木酚类风味物质的功能菌属[21]，这2个优势细菌属在促进白酒风味物质生成方面均具有贡献作用。Weissella和Lactococcus均为高温大曲中较为典型的乳酸菌属，二者在生长代谢过程中产生的乳酸可为酵母属的酯化反应提供底物，进而产生乳酸乙酯等化合物来改善白酒风味[22]。亦有研究指出，Rhodococcus与大曲酸度值的变化呈现显著正相关，进一步为发酵提供了酸性环境[23]。
2.3 高温大曲中可培养细菌的分离鉴定
在使用高通量测序技术对兰陵酒业高温大曲中细菌类群进行解析的基础上，本研究进一步结合传统纯培养方法对大曲中可培养细菌菌株进行了分离与鉴定，继而基于16S rRNA基因序列构建细菌分离菌株的系统发育树，结果如图4所示。
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图 4 高温大曲中部分细菌分离株系统发育树注：在鉴定菌种下各挑选一株分离菌株与模式菌株结合构建系统发育树。Figure 4. Phylogenetic tree of some bacterial isolates in high-temperature Daqu由图4可知，在培养基上分离到的40 株细菌分离株被鉴定为5个属下的10个种，分别为Bacillus下的地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、索诺拉沙漠芽孢杆菌（B. sonorensis）、暹罗芽孢杆菌（B. siamensis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）和副蕈状芽孢杆菌（B. paramycoides），片球菌属（Pediococcus）下的戊糖片球菌（P. pentosaceus），乳杆菌属（Lactobacillus）下的草广布乳杆菌（L. graminis），Lactococcus下的格氏乳球菌（L. garvieae）和Weissella下的类肠膜魏斯氏菌（W. paramesenteroides）。本研究进一步对各细菌分离株的类群构成及其相对含量（某一种细菌分离株数量占总分离株数量的百分比）进行了统计，结果如图5所示。
由图5可知，在高温大曲总分离株中，隶属于Bacillus的细菌分离菌株相对含量较高为90%，其中以B. subtilis、B. licheniformis和B. coagulans这3个种为主，其相对含量分别为37.5%、20.0%和15.0%，而隶属于Pediococcus、Lactobacillus、Weissella和Lactococcus的细菌分离株其相对含量均为2.5%。除此之外，结合2.2高通量测序技术对高温大曲中细菌类群结构的解析，Bacillus亦为大曲中的优势细菌属。WU等[24]的研究表明，Bacillus为一种常见于大曲中的耐热微生物，其在酿造过程中会分泌多种水解酶，例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和葡聚糖酶等，从而促进大分子物质的水解和风味化合物的产生。通过MiSeq测序技术解析发现，兰陵酒业高温大曲中的细菌主要为Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Staphylococcus、Rhodococcus、Weissella和Bacillus等，但采用纯培养技术分离出的细菌主要为Bacillus和Weissella，两者结果存在一定的差异。究其原因可能与细菌分离过程中所使用的培养基种类和培养条件较少有关，在后续研究中应进一步使用“培养组学”的方法，通过设置多重培养基和培养条件对大曲中细菌菌株进行分离，进而实现高温大曲中可培养微生物资源的深度挖掘和保护。
2.4 高温大曲各理化指标的分析
理化性质是鉴别大曲品质好坏的重要依据[18]。本研究首先使用常规检测方法对兰陵酒业15份高温大曲的酸度、水分含量、氨基酸态氮、灰分、淀粉含量、蛋白质含量和5个力等指标进行了测定分析，其结果如表1所示。
表 1 高温大曲各理化指标分析Table 1. Analysis of physicochemical indexes of high-temperature Daqu理化指标 平均值 中位值（最小值，最大值） 标准差 酸度（mmol/10 g） 1.20 1.10（1.00，1.60） 0.20 水分含量（%） 8.59 8.60（8.22，8.94） 0.21 氨基酸态氮（g/kg） 3.67 3.55（2.76，4.52） 0.59 灰分（g/100 g） 2.00 2.00（1.83，2.08） 0.07 淀粉含量（%） 54.57 54.20（50.90，58.50） 2.73 蛋白质含量（%） 15.72 15.65（15.02，16.97） 0.50 糖化力（mg/g·h） 257.93 200（7.00，633.00） 210.22 酯化力（mg/50 g·7 d） 145.93 149（0.00，412.00） 109.87 发酵力（g/0.5 g·72 h） 0.10 0.07（0.05，0.26） 0.06 酒化力（% vol） 2.23 0.3（0.00，7.90） 3.11 液化力（g/g·h） 0.73 0.42（0.13，4.75） 1.16 由表1可知，纳入本研究的高温大曲平均酸度值为1.20 mmol/10 g，水分含量为8.59%，氨基酸态氮为3.67 g/kg，灰分为2.00 g/100 g，淀粉含量为54.57%，蛋白质含量为15.72%，糖化力为257.93 mg/g·h，酯化力为145.93 mg/50 g·7d，发酵力为0.10 g/0.5 g·72 h，酒化力为2.23%vol和液化力为0.73 g/g·h。在测定大曲这11项理化指标的过程中，发现其糖化力和酯化力的数值波动较大，标准差分别为210.22和109.87。有研究指出，大曲在开始培养阶段，由于曲房内温度的升高，不耐高温的菌群生长受到抑制导致大曲糖化力下降，随着翻曲步骤的进行，曲房温度有所降低，微生物类群又逐渐生长并推动了大曲糖化力的回升，与此同时，微生物代谢产物的不断积累亦推动了大曲酯化力的上升[25]，由此可推测，大曲在发酵过程中由于堆放位置的不同使得其受热温度与面积亦有不同，从而产生了同一批次大曲糖化力和酯化力差异较大的现象。除此之外，大曲酒化力和液化力的数值波动亦较大，最小值分别为0% vol和0.13 g/g·h，最大值分别为7.90% vol和4.75 g/g·h。究其原因可能在于Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和Bacillus等菌属具有较强的液化力[25]，且结合细菌多样性研究可知这些菌属在高温大曲中均为优势细菌属，然而受到曲块堆放位置的影响其相对含量在各大曲中明显分布不均一，这种现象可导致大曲液化力和酒化力数值出现波动。大曲酸度值的变化主要是由于曲中产酸菌有机酸代谢以及淀粉和蛋白质等降解活动而形成，适宜的酸度可促进有益菌参与酯化反应从而生成香味物质[26−27]。游离氨基酸是大曲中香气形成的重要前体物质，主要来源于大曲原料中蛋白质的降解[28]。
2.5 高温大曲中细菌类群与理化因子的相关性分析
有研究表明，大曲中理化特性的变化与微生物密切相关[18]。因此，本研究在对高温大曲理化指标和细菌类群进行解析的基础上，进一步对两者之间关联性进行了研究，其相关性热图如图6所示。
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图 6 优势细菌属与理化指标相关性分析注：*代表P<0.05，表示呈现显著相关性；**代表P<0.01，表示呈现极显著相关性。Figure 6. Correlation analysis between dominant bacterial genera and physicochemical indexes由图6可知，兰陵酒业高温大曲中细菌类群与理化指标间存在着较为复杂的相关关系。Kroppenstedtia与酯化力呈显著正相关（P<0.05）。Thermoactinomyces与氨基酸态氮呈显著负相关（P<0.05），与蛋白质含量呈显著正相关（P<0.05）。Staphylococcus和Leucobacter均与发酵力和酒化力呈显著正相关（P<0.05）。Rhodococcus与酯化力呈显著负相关（P<0.05）。Weissella与氨基酸态氮呈显著负相关（P<0.05），与蛋白质含量和液化力均呈显著正相关（P<0.05），与糖化力呈极显著正相关（P<0.01）。Delftia与酸度呈显著正相关（P<0.05）。有研究指出，糖化力与糖化酶有关，酯化力与酯化酶有关，液化力与液化型淀粉酶有关等[29]。由此可见，不同细菌类群在生长代谢过程中可产生大量不同的活性酶系及代谢产物，其群落间的共同作用在一定程度上决定了大曲的理化品质。值得一提的是，有研究指出Bacillus与大曲糖化力和液化力均呈现显著相关性[30]，然而这一结论在本研究中并未得到验证。究其原因可能在于两个方面，一是本研究仅采集了兰陵酒业的15个酒曲样品，样品数量相对不足且地域相对集中；二是由于检测是基于核苷酸序列进行的，因而MiSeq高通量测序技术的检测结果包含了酒曲中具有活性、处于休眠和死亡状态的菌株，因而本研究得出的结论可能与基于纯培养技术得出的结论存在一定的差异。由此可见，在后续研究中通过设置多个采样点并增加样本的采集量，同时在采用纯培养技术对大曲中的芽孢杆菌类群进行分离鉴定的基础上进一步解析其与酒曲糖化力和液化力的关联性，对于本研究结果的验证和巩固是极为必要的。
3. 结论
本研究对兰陵酒业15份高温大曲的细菌类群和理化特性均进行了测定分析，结果发现，大曲中蕴含着大量细菌类群，其主要隶属于Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Staphylococcus、Rhodococcus、Weissella、Bacillus、Delftia、Lactococcus、Leucobacter和Enterococcus，基于纯培养技术发现B. subtilis、B. licheniformis和B. coagulans为可培养优势细菌分离株。大曲间糖化力、酯化力、酒化力和液化力这4个指标的差异较大，酸度、水分含量、氨基酸态氮和灰分等7个理化指标的差异较小，同时Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Staphylococcus、Leucobacter、Rhodococcus、Weissella和Delftia与各理化指标间存在着较为复杂的相关关系，进一步为后续临沂地区酿酒微生物资源的挖掘和大曲品质变化的机理提供了理论依据和数据支撑。同时，基于可培养菌株与优势细菌属间种属的差异，在后续研究中将进一步通过设置多个采样点并增加样本的采集量，使用“培养组学”的方法对大曲中细菌菌株进行分离，可能会使得后续大曲中优势细菌菌株的分离更具有针对性。
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图 1 高温大曲中细菌物种累积箱型图
Figure 1. Box diagram of bacterial species accumulation in high-temperature Daqu
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图 2 平均相对含量>1.0%的细菌门（A）和细菌属（B）分布
Figure 2. Distribution of bacterial phylum (A) and genus (B) with an average relative abundance of >1.0%
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图 3 基于OTU水平的Venn图（A）和平均相对含量>1.0%的核心OTU瀑布图（B）
Figure 3. Venn plot based on OTU level (A) and waterfall plot of core OTU with an average relative abundance of >1.0% (B)
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图 4 高温大曲中部分细菌分离株系统发育树
注：在鉴定菌种下各挑选一株分离菌株与模式菌株结合构建系统发育树。
Figure 4. Phylogenetic tree of some bacterial isolates in high-temperature Daqu
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图 6 优势细菌属与理化指标相关性分析
注：*代表P<0.05，表示呈现显著相关性；**代表P<0.01，表示呈现极显著相关性。
Figure 6. Correlation analysis between dominant bacterial genera and physicochemical indexes
表 1 高温大曲各理化指标分析
Table 1 Analysis of physicochemical indexes of high-temperature Daqu
理化指标 平均值 中位值（最小值，最大值） 标准差 酸度（mmol/10 g） 1.20 1.10（1.00，1.60） 0.20 水分含量（%） 8.59 8.60（8.22，8.94） 0.21 氨基酸态氮（g/kg） 3.67 3.55（2.76，4.52） 0.59 灰分（g/100 g） 2.00 2.00（1.83，2.08） 0.07 淀粉含量（%） 54.57 54.20（50.90，58.50） 2.73 蛋白质含量（%） 15.72 15.65（15.02，16.97） 0.50 糖化力（mg/g·h） 257.93 200（7.00，633.00） 210.22 酯化力（mg/50 g·7 d） 145.93 149（0.00，412.00） 109.87 发酵力（g/0.5 g·72 h） 0.10 0.07（0.05，0.26） 0.06 酒化力（% vol） 2.23 0.3（0.00，7.90） 3.11 液化力（g/g·h） 0.73 0.42（0.13，4.75） 1.16 
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