Application of Cinnamaldehyde Microcapsules in Anti-fungal Preservation of Purple Rice
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摘要: 为对比常见天然植物提取物对紫米优势霉菌的抗菌性能，并探究其在紫米储藏中的应用，本研究分离和纯化发霉紫米中的霉菌，通过显微镜镜检和分子生物学鉴定确定优势霉菌。以此为基础，研究柠檬醛、肉桂醛、对茴香醛、茶多酚、百里香酚、丁香酚六种天然植物提取物对紫米优势霉菌的抑菌性能，选择抑菌性能最好的天然植物提取物并测定其对优势霉菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）及最小杀菌浓度（Minimum Bacterial Concentration，MBC）。然后，通过正交试验优化得到肉桂醛微胶囊最佳制备工艺，将制得的微胶囊干燥后包装于无纺布袋中并应用于35 ℃紫米加速储藏试验。最后，以水分、霉菌含量、气味、色差等作为紫米新鲜度的指标，评价肉桂醛微胶囊对紫米的保鲜效果。结果表明：发霉紫米优势霉菌为Aspergillus versicolor（杂色曲霉）、Aspergillus chevalieri（谢瓦曲霉）、Cladosporium tenuissimum（细枝孢霉）、Aspergillus candidus（亮白曲霉）、Rhizomucor pusillus（微小根毛霉），肉桂醛对上述霉菌抑制效果最佳，并且测得其MIC分别为2、1、1、2、1 mg/mL；MBC分别为4、8、4、16、4 mg/mL。肉桂醛微胶囊最佳制备工艺为：海藻酸钠的浓度为3%，氯化钙的浓度为1%，壁芯比为12:1，造粒液面距离为25 cm，该工艺制得的肉桂醛微胶囊的包埋率为96.67%，载油率为61.27%。肉桂醛微胶囊使紫米的各项新鲜度指标均优于空白对照组，说明所制备的肉桂醛微胶囊对紫米保鲜有积极作用。Abstract: In order to compare the antimicrobial and fungicidal properties of common natural plant extracts against dominant molds in purple rice and to investigate their application in purple rice storage, this study isolated and purified molds in moldy purple rice, and identified the dominant molds by microscopic examination and molecular biology. On this basis, the inhibitory properties of six natural plant extracts, citral, cinnamaldehyde, p-anisaldehyde, tea polyphenols, thymol and eugenol, were investigated against dominant molds of purple rice. The natural plant extracts with the best bacteriostatic properties were selected and their minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bacterial concentration (MBC) against dominant molds were determined. Then the best preparation process of cinnamaldehyde microcapsules was optimized by orthogonal test, and the microcapsules were packed in non-woven bags after drying and applied in the accelerated storage test of purple rice at 35 ℃. Finally, moisture, mold content, odor, and color difference were used as indicators of the freshness of purple rice to evaluate the preservation effect of cinnamaldehyde microcapsules on purple rice. The results showed that the dominant molds of moldy purple rice were Aspergillus versicolor, Aspergillus chevalieri, Cladosporium tenuissimum, Aspergillus candidus and Rhizomucor pusillus, cinnamaldehyde had the best inhibitory effect on the above molds, and its MIC was measured as 2, 1, 1, 2, 1 mg/mL, and MBC was measured as 4, 8, 4, 16, 4 mg/mL, respectively. The optimal preparation process of cinnamaldehyde microcapsules was as follows: The concentration of sodium alginate was 3%, the concentration of calcium chloride was 1%, the wall-core ratio was 12:1, and the distance between the liquid surface of the pelleting was 25 cm, and the encapsulation rate of the cinnamaldehyde microcapsules produced by the process was 96.67%, and the oil-carrying rate was 61.27%. The cinnamaldehyde microcapsules made the freshness indexes of purple rice better than the blank control group, indicating that the prepared cinnamaldehyde microcapsules have a positive effect on the preservation of purple rice.
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Keywords:
- purple rice /
- advantageous molds /
- cinnamaldehyde /
- microcapsules /
- preservation
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紫米作为有色稻米的一种，种植于我国华南地区及云贵地区[1]。紫米的种植积极推动了种植地的乡村振兴[2]，其经济价值正被挖掘[3]。紫米具有较高的营养价值和药用价值，其色氨酸、赖氨酸、蛋白质、硫胺素（B1）、核黄素（B2）、花色苷类多酚物质含量均不同程度高于普通大米[4−5]。随着大众养身观念的增强，紫米的销量也有较大幅度的提升，其种植面积及产量也呈提升态势[6]。然而紫米中的碳水化合物、脂肪、蛋白质等物质容易被氧化[7−8]，也容易被微生物侵入[9]，导致发霉变质从而改变紫米品质[8,10]。目前市面上对于延长稻米类产品货架期的方法主要集中在对产品本身的处理（射频[11]、干燥[12]等）、包装方式的改变（气调[13]、真空[14]等）、包装材料的选择（纳米材料[15]、复合膜[16]等）以及储藏环境的控制（温度[17]、CO2含量[18]等）。以上方法虽然能够一定程度上延长紫米的货架期，但是其短板仍十分明显，或消耗大量能源、或需提前制备特殊材料。
柠檬醛、肉桂醛、对茴香醛、茶多酚、百里香酚、丁香酚是天然植物提取物[19]，它们具有优秀的抗菌、抑菌活性[20]，但其在室温下挥发性较大[21]、易氧化[22]、对光源、热源敏感[23]，不易保存。微胶囊技术是一种高效控释技术，它是利用一个或多个壁材包裹芯材，达到保护芯材、控释芯材的目的[24−26]。将上述提取物包裹进微胶囊中，能有效限制其挥发。并且通过包埋不同物质，能够实现对特定霉菌的抑制。现阶段，植物提取物微胶囊主要应用在薄膜中，利用添加了微胶囊的薄膜对内装物进行包裹，通过微胶囊在薄膜中的缓释作用释放提取物以延长内装物的货架期[27−29]。包装对象集中在生鲜品类，如鱼类、肉类、蔬菜类等等。然而，尚未见将上述提取物用于紫米防霉抑菌方面的研究报道。
本研究通过分离纯化发霉紫米中的优势霉菌，探讨柠檬醛、肉桂醛、对茴香醛、茶多酚、百里香酚、丁香酚等六种天然植物提取物对优势霉菌的抑制效果，比较得出抑菌性最佳的提取物，并采用锐孔凝固浴法将其包裹于海藻酸钠中，使用氯化钙溶液进行固化，经过滤干燥后制成微胶囊，以延长该提取物的挥发期，实现控释效果。最后，将其利用于紫米储藏，在使用时，只需将提前制备的微胶囊直接放入原包装中，无需对包材或内装物进行提前处理，既实现“随放随用”的便捷应用目的，又实现延长紫米防霉保鲜周期的效果，为紫米储藏保鲜提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
“天紫一号”紫米（2022年产） 广东省云浮市新兴县微丰农业科技有限公司；无水乙醇 分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；孟加拉红培养基 广东环凯微生物科技有限公司；肉桂醛、对茴香醛、柠檬醛、茶多酚、百里香酚、丁香酚、吐温-20 上海麦克林生化科技有限公司；氯化钙、一水合柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠 天津市科密欧化学试剂有限公司；生理盐水 辰欣药业股份有限公司；马铃薯葡萄糖水、马铃薯葡萄糖琼脂 广东环凯科学有限公司。
超净工作台 苏州净化设备有限公司；LDZX-50L立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；LHS-250SC恒温恒湿箱 上海齐欣科学仪器有限公司；SHA-CA恒温水浴振荡器 常州澳华仪器有限公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；UV-4802S紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；LSPP02-2B注射泵 保定兰格恒流泵有限公司；JBB90-D强力电动搅拌机 上海标本模型厂；FA2104电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ML31-M生物显微镜 广州市明美光电技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发霉紫米优势霉菌的分离
将25 g发霉紫米倒入装有225 mL无菌水和若干玻璃珠的三角瓶中，放入振荡器中振荡30 min。取0.2 mL原液至孟加拉红培养基中在28±1 ℃下培养5~10 d，等待菌丝长出。在超净工作台中，将长出的菌落转接到高盐察氏培养基中，同温（28±1 ℃）培养96 h，得到疑似霉菌的单菌落。
对疑似霉菌的单菌落进行肉眼观察，根据单菌落的形态、颜色等外观特征进行分类。在超净工作台中用接种针挑取单菌落中的气生菌丝并转接到高盐察氏培养基进行培养。从肉眼无法分辨明显杂菌开始，在28±1 ℃的温度下连续培养三代，挑取菌丝至有乳酸石炭酸棉兰染液的载玻片上，用显微镜观察确保菌种一致。将菌种保存于试管斜面上，置于4 ℃备用。
1.2.2 发霉紫米优势霉菌的显微镜鉴定
用三点点植法将纯化后的霉菌点接到高盐察氏培养基中，在28±1 ℃的温度下培养5 d，观察并记录菌落生长速度、直径、边缘特征、颜色、渗出物和培养基颜色变化。用接种针挑取菌落边缘带有孢子的菌丝，在无菌蒸馏水中洗去多余孢子，转入滴有乳酸石炭酸棉兰染液的载玻片并用解剖针挑散菌丝，盖好盖玻片后用显微镜进行观察。
1.2.3 发霉紫米优势霉菌的分子生物学鉴定
模板处理：挑取菌体变性处理后离心取上清为模板，选择相应引物扩增测序验证。
PCR扩增回收：利用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，引物序列：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反应体系和程序见表1和表2。
表 1 PCR反应体系Table 1. PCR reaction system试剂名称 体积 10× PCR Buffer dNTP（each 10 mmol/L） Taq Plus DNA Polymerase 5 U/μL 50 mmoL/L MgSO4 共12.5 引物F（10 µmol/L） 1 引物R（10 µmol/L） 1 Template（DNA） 1 ddH2O 9.5 Total 25 表 2 PCR反应程序Table 2. PCR reaction procedure温度（°C） 时间 循环 95 5 min 预变性 94 30 s 30cycle 57 30 s 30cycle 72 90 s 30cycle 72 10 min 修复延升 使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131/SK8182）切胶回收目的片段以对应的引物进行测序。将测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对，选择同源性高的菌株，构建系统进化树。
1.2.4 抑菌物质的筛选
用牛津杯法测定肉桂醛、柠檬醛、对茴香醛、丁香酚、茶多酚、百里香酚这六种天然植物提取物对1.2.1分离出的优势菌种的抑菌圈大小。选择对霉菌抑制效果最好的提取物，进行最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC测定。
1.2.5 最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）
用试管法分别测定六种提取物的最小抑菌浓度。对梯度浓度（64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL）的植物提取物稀释液试管进行编号，分别加入0.8 mL PDB培养基，0.1 mL不同浓度的稀释液和0.1 mL菌悬液105~106 spores/mL，并设0.1 mL、50%乙醇为空白对照组，平行3次。将上述试管在28 ℃中培养24 h，观察浑浊度，若浑浊则为有菌，选取最小浓度的非浑浊试管，其浓度即为最小抑菌浓度MIC。
1.2.6 最小杀菌浓度（Minimum Bacterial Concentration，MBC）
在最小抑菌浓度MIC的基础上，将非浑浊的试管筛选出，并分别取0.1 mL培养液至10 mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，摇晃均匀，做0.1 mL吐温-20空白对照，平行3次，28 ℃培养24 h。取0.1 mL菌悬液涂布于上述平板上，培养24 h。观察平板表面有无菌落生长，选择无菌生长的最小浓度为最小杀菌浓度MBC。
1.2.7 肉桂醛微胶囊的制备
1.2.7.1 正交试验
以前期单因素实验结果为依据，选取海藻酸钠浓度（A）、氯化钙浓度（B）、壁芯比（C）、造粒液面距离（D）为正交试验因素，依照表3进行L9（34）水平进行试验，以包埋率作为评价指标，对肉桂醛微胶囊制造工艺进行优化。肉桂醛乳液制备方法为：在30 mL肉桂醛与海藻酸钠混合液中滴加3 mL吐温-20，并加盖搅拌30 min，使肉桂醛充分分散到海藻酸钠体系中，以包埋率作为肉桂醛微胶囊的品质指标，得到最佳工艺配方并测定该配方下的载油率。
表 3 正交试验因素水平设计Table 3. Orthogonal test factor level design
水平A B C D 海藻酸钠浓度（%） 氯化钙浓度（%） 壁芯比 造粒液面距离（cm） 1 2 0.50 12:1 15 2 2.50 1 15:1 20 3 3 1.50 18:1 25 1.2.7.2 包埋率、载油率测定
将0.15 g微胶囊试样放入离心管后加入30 mL柠檬酸钠-无水乙醇混合溶液（5%柠檬酸钠:无水乙醇=1:1（V/V）），超声处理30 min，并静置36 h，取上层清液，利用紫外-分光光度计在292 nm（最大吸收波长，已在前期测定）处测量其吸光度值，根据标准曲线，代入式（1）计算得微胶囊包含肉桂醛总量Va。另取0.15 g微胶囊试样加入30 mL无水乙醇，其余步骤同上，得到微胶囊表面肉桂醛量Vf。依照式（2）计算得到包埋率，式（3）计算得到载油率：
y=0.0563x+0.06(R2=0.9951) (1) Re(%)=Va−VfVa×100 (2) S(%)=(Va−Vf)×ρ0.15×100 (3) 式（1）中，x表示肉桂醛-柠檬酸-无水乙醇溶液的体积浓度；y则表示肉桂醛-柠檬酸-无水乙醇溶液在入射波长为292 nm处的吸光度值；决定系数R2=0.9951。
式（2）中，Re为肉桂醛微胶囊包埋率（%）；Va为肉桂醛微胶囊包含肉桂醛总量（mL）；Vf为肉桂醛微胶囊表面肉桂醛量（mL）。
式（3）中，S为肉桂醛微胶囊载油率（%）；Va为肉桂醛微胶囊包含肉桂醛总量（mL）；Vf为肉桂醛微胶囊表面肉桂醛量（mL）；ρ为肉桂醛密度1.05 g/mL。
1.2.8 肉桂醛微胶囊在紫米储藏中的应用
1.2.8.1 储藏条件
根据正交试验所得最佳工艺制备肉桂醛微胶囊，得到湿胶囊后用蒸馏水充分清洗并过滤，平铺于蒸发皿中，置于30 ℃恒温恒湿箱中干燥，得到干胶囊。将干燥后的微胶囊按照0.5、1、2 g的规格热封于无纺布袋中，放入紫米包装中，进行紫米储藏试验。以水分、形态、霉菌含量、气味、色差作为紫米的品质指标，衡量肉桂醛微胶囊的加入对其新鲜度的影响。
1.2.8.2 水分测定
参照GB 5009.3-2016干燥法[30]，以干燥前后紫米的质量差作为被测紫米样的水分含量。
1.2.8.3 形态观察
随机取样一定量的紫米放入一次性培养皿中，置于相同光源环境下且相机设置参数相同进行拍照，观察紫米形态变化。
1.2.8.4 霉菌含量测定
参照GB 4789.15-2016霉菌和酵母菌计数[31]，确定被测紫米样中的霉菌含量。
1.2.8.5 气味分析
准确称取30 g紫米待测样于100 mL烧杯中，利用保鲜膜将烧杯密封，并置于30 ℃恒温培养箱中2 h（每30 min摇晃一次）。利用便携式电子鼻检测系统（Airsense PEN3，German）测定紫米待测样气味。电子鼻检测系统具体调试参数为：采样间隔1 s，冲洗时间120 s，调零时间10 s，预采样时间5 s，检测时间120 s，载气流速、进样流速300 mL/min，每种样品重复测3次。选取80~85 s的响应值进行主成份分析（PCA）和LOD分析。电子鼻传感器的性能描述见表4。
表 4 电子鼻传感器性能描述Table 4. Electronic nose sensor performance description阵列序号 传感器名称 性能描述 1 WIC 芳香成分 2 W5S 灵敏度大，对氮氧化合物很灵敏 3 W3C 氨水，对芳香成分灵敏 4 W6S 主要对氢气有选择性 5 W5C 烷烃芳香成分 6 W1S 对甲烷灵敏 7 W1W 对硫化物灵敏 8 W2S 对乙醇灵敏 9 W2W 芳香成分，对有机硫化物灵敏 10 W3S 对烷烃灵敏 1.2.8.6 色差分析
将混合均匀的紫米待测样迅速研磨至95%能通过40目筛的细微颗粒，取适量颗粒于一次性培养皿并压实。用FD-5BT分光密度计选用L*、a*、b*模式测样品，以ΔE作为紫米待测样色泽的评价指标，ΔE由式（4）计算得到。每个样品随机测定3次。
ΔE=√ΔL∗2+Δa∗2+Δb∗2 (4) 式中：ΔE为总色差；ΔL*为亮度差；Δa*、Δb*为色度差。
1.3 数据处理
利用Excel2021、OriginPro9.0、SPSS24.0、Winmuster、MEGA7.0等软件进行数据分析，结果采用平均值±标准偏差的形式呈现。
2. 结果与分析
2.1 紫米优势霉菌分离鉴定结果与分析
2.1.1 霉菌的分离与纯化
为初步将培养出的菌落进行分类，采用1.2.1的方法得到发霉紫米中的疑似霉菌，如图1所示。从图1中可看出，孟加拉红培养基上有15种形态不同的菌落，初步确定为疑似霉菌，分别标记为M1~M15。
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图 1 15种疑似霉菌在孟加拉红培养基上的菌落形态Figure 1. Colony morphology of 15 suspected mycobacteria on Bengal red medium2.1.2 霉菌的显微镜特征分析
经过三代再培养后，可依据菌落形态、颜色、边缘等外观特征将分离出的15种不同形态的菌落进一步细化，最终确定5种疑似霉菌，分别重新编号为：M1、M2、M3、M4、M5。采用三点点植法培养后得到图2的5类菌落。
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图 2 5种霉菌在高盐察氏培养基及光学显微镜下的形态Figure 2. Morphology of five species of mycobacteria in high-salt Tscha medium and under light microscopeM1菌落直径2~4 cm，菌落中心为黄色圆状，并伴有深色圆环，菌落外圈为白色绒状、光滑、有明显界限。孢子顶囊为类球状，分生孢子为球状。M2菌落直径3~5 cm，菌落整体呈现黄色，其中中心颜色较深，并伴有深色圆环，菌落外部呈现放射絮状。孢子顶囊为类球状，分身孢子为球状。M3菌落直径1~2 cm，菌落中心为深绿色圆状，有明显的渐变。菌落外圈为白色绒状，有明显界限。孢子为纺锤状。M4菌落直径为2~4 cm，菌落中心有空洞，整体为白色，边缘光滑、有明显界限。孢囊呈烧瓶状。M5菌落直径为1~3 cm，菌落整体为白色，颜色偏浅，菌丝较稀疏。菌落中心有黑色圆点。孢囊呈花蕊状，孢子为类球状。
2.1.3 菌种分子生物学鉴定与系统发育树的构建
对5种霉菌进行分子生物学鉴定能够精确辨别菌种类型，用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'分别对上述5种疑似菌种进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。图3为5种疑似霉菌的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，观察图中DNA带可以发现，其单一且清晰，说明被测物为初培养物，不存在同源区结合位点，所分离提纯的DNA纯度比较高。经过ITS基因测序，得到了其基因序列，并将该基因序列放于GenBank中结合形态进行比对，确定5种霉菌为Aspergillus versicolor（杂色曲霉）、Aspergillus chevalieri（谢瓦曲霉）、Cladosporium tenuissimum（细枝孢霉）、Aspergillus candidus（亮白曲霉）、Rhizomucor pusillus（微小根毛霉）。选择其中同源性较高的菌株，使用MEGA构建系统发育树，得到结果如图4。
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图 3 5种疑似霉菌的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Figure 3. Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of five suspected mycobacteria2.2 抑菌物质的筛选结果与分析
2.2.1 六种植物提取物对霉菌的抑菌效果分析
根据表5可知，肉桂醛在5种霉菌中均表现出较好的抑制性，其抑制效果均优于其余5种植物提取物。其中，肉桂醛对杂色曲霉及谢瓦曲霉的抑制效果最为突出，在其他低浓度植物提取物未表现出抑制性时，肉桂醛已经能够抑制这两种霉菌的生长。
表 5 6种植物提取物对5种霉菌的抑菌效果Table 5. Antibacterial effects of 6 plant extracts on 5 types of molds抑菌成分 抑菌效果 杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 低 中 高 低 中 高 低 中 高 低 中 高 低 中 高 柠檬醛 − − − − − − − ++ +++ − − + − ++ ++ 肉桂醛 − ++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ − + +++ ++ ++ +++ 对茴香醛 − − − − − − − ++ ++ − − − − − − 丁香酚 − − − − ++ ++ − ++ +++ − + + − − ++ 茶多酚 − − − − ++ ++ − − − − − − − − − 百里香酚 − − ++ − − ++ − ++ +++ − + + ++ ++ +++ 注：表中低、中、高浓度分别对应1、2、4 mg/mL；“−”代表无抑制性，“+”代表有抑制性，且“+”数量与抑制性呈正相关。 肉桂醛对发霉紫米中的杂色曲霉、谢瓦曲霉、细枝孢霉、亮白曲霉、微小根毛霉表现出较佳的抑制效果。肉桂醛通过破坏霉菌的细胞膜，导致细胞质暴露而漏出，使霉菌失去生物活性[32−34]。肉桂醛还能和丝状温度敏感蛋白Z（FtsZ）结合，抑制细胞分裂的过程[32−35]。故选用肉桂醛作为芯材制成微胶囊并探讨其在紫米储藏中的应用。
2.2.2 肉桂醛的MIC
采用试管法测定肉桂醛稀释液对五种优势霉菌的最小抑菌浓度MIC，结果如表6所示，肉桂醛对杂色曲霉、谢瓦曲霉、细枝孢霉、亮白曲霉、微小根毛霉的最小抑菌浓度分别为：2、1、1、2、1 mg/mL。
表 6 不同浓度的肉桂醛对优势霉菌的抑菌效果Table 6. Antibacterial effects of different concentrations of cinnamaldehyde on dominant mould肉桂醛溶液浓度
（mg/mL）杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 64 − − − − − 32 − − − − − 16 − − − − − 8 − − − − − 4 − − − − − 2 − − − − − 1 + − − + − 0.5 + + + + + 0.25 ++ ++ + ++ ++ 0.125 ++ +++ + ++ ++ 0.0625 +++ +++ ++ +++ ++ 注：表中“−”代表无菌生成，“+”代表有菌生成，且“+”数量与菌数量呈正相关，表7同。 2.2.3 肉桂醛的MBC
如表7所示，肉桂醛稀释液对杂色曲霉、谢瓦曲霉、细枝孢霉、亮白曲霉、微小根毛霉的最小杀菌浓度MBC分别为：4、8、4、16、4 mg/mL。
表 7 不同浓度的肉桂醛对优势霉菌的杀菌效果Table 7. Bactericidal effects of different concentrations of cinnamaldehyde on dominant mould肉桂醛溶液浓度
（mg/mL）杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 64 − − − − − 32 − − − − − 16 − − − − − 8 − − − + − 4 − + − ++ − 2 + + + ++ + 1 +++ +++ ++ 2.3 肉桂醛微胶囊最佳制备工艺
由表8中极差R可知，各因素对微胶囊的包埋率的作用大小顺序为：海藻酸钠浓度>壁芯比>氯化钙浓度>造粒子液面距离。由表8中k值可知，理论最佳组合为：A3B3C3D3（即：海藻酸钠浓度3%，氯化钙浓度1.5%，壁芯比为18:1，造粒液面距离为25 cm），实验得到该组合包埋率为94.78%。而通过正交试验9组结果可知，其最佳组合为A3B2C1D3（即：海藻酸钠的浓度为3%，氯化钙的浓度为1%，壁芯比为12:1，造粒液面距离为25 cm），该组合包埋率为96.67%。综上，选用海藻酸钠的浓度为3%，氯化钙的浓度为1%，壁芯比为12:1，造粒液面距离为25 cm的最佳工艺制备肉桂醛微胶囊，该制造工艺下的微胶囊包埋率为96.70%，肉桂醛载油率为61.27%。所制得肉桂醛微胶囊外观状态如图5~图6所示，湿囊直径较大，状态饱满，呈白色；干囊直径较小，状态干瘪，呈淡黄色。
表 8 正交试验设计及结果Table 8. Design and results of orthogonal experimental实验号 A B C D 包埋率（%） 1 1 1 1 1 36.80 2 1 2 2 2 44.67 3 1 3 3 3 53.56 4 2 1 2 3 86.72 5 2 2 3 1 94.68 6 2 3 1 2 88.93 7 3 1 3 2 93.18 8 3 2 1 3 96.70 9 3 3 2 1 94.79 K1 135.03 216.7 200 226.27 K2 270.33 236.05 222.43 226.78 K3 284.67 237.28 241.42 236.98 k1 45.01 72.23 66.67 75.42 k2 90.11 78.68 74.14 75.59 k3 94.89 79.09 80.47 78.99 R 49.88 6.86 13.8 3.57 2.4 肉桂醛微胶囊在紫米储藏中的应用分析
2.4.1 水分含量分析
如图7可见，在35 ℃加速储藏的情况下，初始紫米水分为13.68 g/100 g。因为紫米在较高温度储存，内部微生物呼吸作用需要消耗水分[36]，紫米水分含量总体呈现下降的趋势。其中，以添加3 g肉桂醛微胶囊的紫米水分含量曲线最缓，在第56 d时，其水分含量最多，为12.69 g/100 g，而0.5、1、2 g组紫米的水分含量分别为12.28、12.18、12.06 g/100 g，其原因可能是：紫米具有吸水性[37]，而干燥后的肉桂醛微胶囊也具有吸水性，且由于微胶囊表面于包装内环境的湿度差更大其对水分的吸附作用更强。在紫米包装中，当肉桂醛微胶囊数量越多，其抢先吸附的水分越多，紫米后续吸附的水分就越少。可以看出肉桂醛微胶囊对紫米保藏有积极作用，能够有效延长其保鲜周期。
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图 7 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d水分含量变化Figure 7. Changes in moisture content of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days2.4.2 形态分析
如图8所示，CK、0.5、1、2、3 g组在7~56 d的形态变化。可以发现，紫米颜色随着时间推移而变浅，而光泽也渐渐消退，这是因为高温诱导过氧化氢酶使花青素氧化[17]，而露出紫米内部颜色[38]。各组别均未在紫米表面观察到明显霉菌，肉桂醛微胶囊添加量为3 g的组别在第56 d时形态保持最好，也能够说明肉桂醛微胶囊的添加对紫米保鲜周期延长具有积极意义。
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图 8 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d形态变化Figure 8. Accelerated morphological changes of purple rice added with different masses of cinnamaldehyde microcapsules for 56 days2.4.3 霉菌含量分析
因为紫米富含营养物质，随着储藏天数的增加，霉菌含量呈现上升趋势[16]。如图9所示，以CK组增长最为迅速，肉桂醛微胶囊添加量为3 g的组别最为缓和。在0 d时，各组别霉菌含量均为0 CFU/g，当贮藏56 d时，CK、0.5、1、2、3 g组的霉菌含量分别为1.63×105、8.69×104、2.20×104、8.90×103、5.60×103 CFU/g。CK组的霉菌含量已经超过安全水平线105 CFU/g，说明该方法不适合紫米储藏。在56 d时，五个组别的霉菌含量严格按照肉桂醛微胶囊的添加量而逆向排序，即3 g<2 g<1 g<0.5 g<CK，亦可说明肉桂醛微胶囊对紫米保鲜周期的延长具有积极意义。
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图 9 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d霉菌含量变化Figure 9. Variation of mycobacterial content of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days2.4.4 气味分析
图10、图11分别添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速储藏56 d的Loadings图和PCA图。由图10可知，第一主成分的贡献率为91.39%，第二主成分的贡献率为7.69%，总贡献率为99.08%，已经超过85%[39−40]，可以代表紫米样品的整体气味。W1W及W2W传感器在测量中反应最明显，前者对硫化物灵敏，后者对芳香成分及有机硫化物灵敏。结合图11可以看出，随着储藏时间的推移，各组别的紫米中硫化物的含量先增加后减少，芳香成分及有机硫化物降低。硫化物减少是因为紫米中蛋白质被氧化，挥发性硫化物减少[41]。紫米的挥发性香味成分主要有醛类、酮类、醇类、酯类、烃类等[42]，W2W响应值降低，可能是因为肉桂醛微胶囊缓慢释放的肉桂醛被紫米吸附导致影响测量值，说明肉桂醛微胶囊的添加会影响紫米整体气味。
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图 10 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d气味变化的Loadings图Figure 10. Loadings of odor changes of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days![]()
图 11 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d气味变化的PCA图Figure 11. PCA of odor changes of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days2.4.5 色差分析
一般认为色差变化ΔE>3可认为颜色有较明显变化，如图12所示，CK、0.5、1、2、3 g组分别在28、35、35、35、49 d时ΔE超过3，肉桂醛微胶囊添加量为3 g组ΔE超过3的时间最晚，说明其颜色变化最慢。在56 d时，CK、0.5、1、2、3 g组的ΔE分别为5.114、5.126、4.966、4.879、4.465，将其依照ΔE大小排序为CK>0.5 g>1 g>2 g>3 g。在试验结束时，肉桂醛微胶囊添加量为3 g的组颜色变化最少，说明该组紫米的储藏效果最好，证明肉桂醛微胶囊对紫米保鲜周期的延长有积极意义。
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图 12 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d色差变化Figure 12. Accelerated color variation of purple rice added with different quality of cinnamaldehyde microcapsules for 56 days3. 结论
本研究通过分离纯化发霉紫米中的优势菌种，得到杂色曲霉、谢瓦曲霉、细枝孢霉、亮白曲霉、微小根毛霉等5种优势菌种，并研究柠檬醛、肉桂醛、对茴香醛、茶多酚、百里香酚、丁香酚等六种天然植物提取物对上述优势菌种的抑制性，发现肉桂醛对其抑制性最强。将肉桂醛包裹于海藻酸钠壁材制成肉桂醛微胶囊以控制其挥发，并达到缓释效果。最后，将所制得的肉桂醛微胶囊应用于紫米储藏，并以水分、形态、霉菌含量、气味、色差作为新鲜度指标，发现使用肉桂醛微胶囊保藏的紫米的各项指标均优于空白对照组，说明所制备的肉桂醛微胶囊在紫米储藏保鲜中具有较好的应用潜力。
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图 1 15种疑似霉菌在孟加拉红培养基上的菌落形态
Figure 1. Colony morphology of 15 suspected mycobacteria on Bengal red medium
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图 2 5种霉菌在高盐察氏培养基及光学显微镜下的形态
Figure 2. Morphology of five species of mycobacteria in high-salt Tscha medium and under light microscope
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图 3 5种疑似霉菌的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
Figure 3. Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of five suspected mycobacteria
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图 7 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d水分含量变化
Figure 7. Changes in moisture content of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days
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图 8 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d形态变化
Figure 8. Accelerated morphological changes of purple rice added with different masses of cinnamaldehyde microcapsules for 56 days
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图 9 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d霉菌含量变化
Figure 9. Variation of mycobacterial content of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days
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图 10 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d气味变化的Loadings图
Figure 10. Loadings of odor changes of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days
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图 11 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d气味变化的PCA图
Figure 11. PCA of odor changes of purple rice with different quality of cinnamaldehyde microcapsules accelerated for 56 days
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图 12 添加不同质量肉桂醛微胶囊的紫米加速56 d色差变化
Figure 12. Accelerated color variation of purple rice added with different quality of cinnamaldehyde microcapsules for 56 days
表 1 PCR反应体系
Table 1 PCR reaction system
试剂名称 体积 10× PCR Buffer dNTP（each 10 mmol/L） Taq Plus DNA Polymerase 5 U/μL 50 mmoL/L MgSO4 共12.5 引物F（10 µmol/L） 1 引物R（10 µmol/L） 1 Template（DNA） 1 ddH2O 9.5 Total 25 
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表 2 PCR反应程序
Table 2 PCR reaction procedure
温度（°C） 时间 循环 95 5 min 预变性 94 30 s 30cycle 57 30 s 30cycle 72 90 s 30cycle 72 10 min 修复延升
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表 3 正交试验因素水平设计
Table 3 Orthogonal test factor level design
水平A B C D 海藻酸钠浓度（%） 氯化钙浓度（%） 壁芯比 造粒液面距离（cm） 1 2 0.50 12:1 15 2 2.50 1 15:1 20 3 3 1.50 18:1 25
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表 4 电子鼻传感器性能描述
Table 4 Electronic nose sensor performance description
阵列序号 传感器名称 性能描述 1 WIC 芳香成分 2 W5S 灵敏度大，对氮氧化合物很灵敏 3 W3C 氨水，对芳香成分灵敏 4 W6S 主要对氢气有选择性 5 W5C 烷烃芳香成分 6 W1S 对甲烷灵敏 7 W1W 对硫化物灵敏 8 W2S 对乙醇灵敏 9 W2W 芳香成分，对有机硫化物灵敏 10 W3S 对烷烃灵敏
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表 5 6种植物提取物对5种霉菌的抑菌效果
Table 5 Antibacterial effects of 6 plant extracts on 5 types of molds
抑菌成分 抑菌效果 杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 低 中 高 低 中 高 低 中 高 低 中 高 低 中 高 柠檬醛 − − − − − − − ++ +++ − − + − ++ ++ 肉桂醛 − ++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ − + +++ ++ ++ +++ 对茴香醛 − − − − − − − ++ ++ − − − − − − 丁香酚 − − − − ++ ++ − ++ +++ − + + − − ++ 茶多酚 − − − − ++ ++ − − − − − − − − − 百里香酚 − − ++ − − ++ − ++ +++ − + + ++ ++ +++ 注：表中低、中、高浓度分别对应1、2、4 mg/mL；“−”代表无抑制性，“+”代表有抑制性，且“+”数量与抑制性呈正相关。
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表 6 不同浓度的肉桂醛对优势霉菌的抑菌效果
Table 6 Antibacterial effects of different concentrations of cinnamaldehyde on dominant mould
肉桂醛溶液浓度
（mg/mL）杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 64 − − − − − 32 − − − − − 16 − − − − − 8 − − − − − 4 − − − − − 2 − − − − − 1 + − − + − 0.5 + + + + + 0.25 ++ ++ + ++ ++ 0.125 ++ +++ + ++ ++ 0.0625 +++ +++ ++ +++ ++ 注：表中“−”代表无菌生成，“+”代表有菌生成，且“+”数量与菌数量呈正相关，表7同。
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表 7 不同浓度的肉桂醛对优势霉菌的杀菌效果
Table 7 Bactericidal effects of different concentrations of cinnamaldehyde on dominant mould
肉桂醛溶液浓度
（mg/mL）杂色曲霉 谢瓦曲霉 细枝孢霉 亮白曲霉 微小根毛霉 64 − − − − − 32 − − − − − 16 − − − − − 8 − − − + − 4 − + − ++ − 2 + + + ++ + 1 +++ +++ ++
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表 8 正交试验设计及结果
Table 8 Design and results of orthogonal experimental
实验号 A B C D 包埋率（%） 1 1 1 1 1 36.80 2 1 2 2 2 44.67 3 1 3 3 3 53.56 4 2 1 2 3 86.72 5 2 2 3 1 94.68 6 2 3 1 2 88.93 7 3 1 3 2 93.18 8 3 2 1 3 96.70 9 3 3 2 1 94.79 K1 135.03 216.7 200 226.27 K2 270.33 236.05 222.43 226.78 K3 284.67 237.28 241.42 236.98 k1 45.01 72.23 66.67 75.42 k2 90.11 78.68 74.14 75.59 k3 94.89 79.09 80.47 78.99 R 49.88 6.86 13.8 3.57
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