Process of Extraction Protein from Selenium-enriched Lyophyllum decastes Mycelia and Analysis of Its Amino Acid
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摘要: 以20 L生物发酵罐培养的富硒荷叶离褶伞菌丝体为原料，对菌丝体中蛋白提取工艺进行优化，并分析硒的富集对荷叶离褶伞菌丝体中氨基酸种类和含量的影响。利用单因素实验和Box-Benhnken中心组合响应面试验法，优化了荷叶离褶伞菌丝体中硒蛋白提取工艺，采用3,3'-二氨基联苯胺分光光度法测定蛋白质中硒的含量，并通过氨基酸测定仪分析测定富硒前后的菌丝体蛋白中氨基酸量的变化。结果表明，荷叶离褶伞菌丝体中硒蛋白的最适提取条件为：提取温度64 ℃、提取时间60 min、液料比200:1 mL/g、提取次数2次，经过验证性试验，测得蛋白提取率为75.13%，菌丝体中富硒量达到63.87 μg/g。采用氨基酸测定仪分析氨基酸的组成，并通过氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS）指标对富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白质进行初步营养价值评价。富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质中氨基酸种类齐全，人体必需氨基酸含量为17.20 g/100 g，较未富硒的高出19.75%，必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）为0.51，接近WHO提出的推荐值，AAS和CS的值接近于模式蛋白。说明经过工艺优化可以提高蛋白质提取率，在富硒菌丝体蛋白质中含有硒，硒促进了氨基酸含量的增加，富硒菌丝体中蛋白质的营养价值较未富硒菌丝更高，富硒菌丝体具有潜在的食用和应用价值。Abstract: The process of extracting seleno-protein from the selenium enriched Lyophyllum decastes mycelia cultured in a 20 L fermentor was optimized, and the effects of selenium enrichment on both types and contents of amino acids in Lyophyllum decastes mycelia were analyzed. Single factor tests and Box-Benhnken central combined response surface test were used to optimize process of extracting seleno-protein from Lyophyllum decastes mycelia. The content of protein was determined by 3,3'-diaminobenzidine spectrophotometry. The types and contents of amino acids in mycelia protein before and after selenium enrichment were compared by means of amino acid analyzer. The results showed that the optimal conditions of extracting seleno-protein from mycelia of Lyophyllum decastes were extraction temperature of 64 ℃, extraction time of 60 min, liquid-solid ratio of 200:1 g/mL, and extraction times of 2. The protein extraction rate was 75.13%, and the content of selenium in mycelia was 63.87 μg/g. The amino acid composition were analyzed by means amino acid score (AAS) and chemical score (CS), and the nutritional value of the protein in the selenium-enriched Lyophyllum decastes mycelia was evaluated. The varieties of amino acids in the selenium-enriched Lyophyllum decastes mycelia were abundant and the content of essential amino acids for human body was 17.20 g/100 g, 19.75% higher than that in the non-selenium-ecriched Lyophyllum decastes mycelia. The ratio of EAA/NEAA was 0.51, close to the recommended value proposed by WHO, and the values of both AAS and CS were close to the those in the model protein. In summary, the protein extraction rate could be improved by optimizing the extraction process, and there was selenium in the protein from selenium-enriched mycelia, which promoted the increase of amino acid content. The nutritional value of protein in selenium-enriched mycelia was higher than that in non-selenium-riched mycelia, and selenium-enrichec mycelia had potential edible and application value.
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硒是生物体必需的微量矿质元素[1]，对人类健康有着极其重要的作用。人体硒的主要来源是通过食物摄入[2]，但是人们很难从本土自然食物中摄入硒以达到补硒的目的。人工外源施硒培养技术可以提高食物中硒的含量。食用菌具有从生长底物中吸收硒的能力，通过菌丝体的代谢，将无机硒转化为有机硒，有机硒主要以硒蛋白质、硒多糖、硒核酸、含硒多肽、硒黄酮等形式存在，其中又以含硒蛋白为主[3]。食用菌经富硒处理后不仅提升了本身的营养功效，还能更好地被人体吸收[4]，可以用于生产高硒新型食品补充剂[5]。
近年来，随着人们生活水平提高及对健康的重视，味道鲜美、营养丰富、绿色健康的食用菌及其制品越来越受到消费者的喜爱。荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes）被称作香味松口蘑或美味玉蕈，是离褶伞属一种市场前景较好的珍稀食用菌[6]，也是一种药用真菌[7]。蛋白质营养是衡量食物营养的重要组成部分[8]，也是对食用菌营养学评价的一个重要方面，也是氨基酸种类和含量评价的重要指标。研究表明，荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质含量大于20%，蛋白质的均衡性优于子实体，营养价值比子实体更高，极具生产和食用价值[9]。此外，荷叶离褶伞还具有较强的富硒能力[10]，硒在摄入人体后可以增加机体中硒蛋白含量[11]，提升其营养价值。目前国内外有关荷叶离褶伞硒蛋白的报道还很少，有必要对富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质提取工艺进行优化。
因此，本试验以富硒的荷叶离褶伞菌丝体为原料，采用超声辅助提取，对蛋白的提取工艺进行优化，并对蛋白质中硒的含量进行测定，以氨基酸分析测定仪检测荷叶离褶伞菌丝体富硒前后，蛋白质中的氨基酸种类和数量的变化，了解硒对荷叶离褶伞菌丝体中氨基酸的影响，为进一步研发食用菌富硒菌丝蛋白质保健品提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料和仪器
荷叶离褶伞1022菌株 甘肃省应用真菌工程实验室提供；标准牛血清蛋白（分析纯）、硒粉（化学纯CP）、3,3'-二氨基联苯胺（化学纯CAS） 国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯；玉米粉、大豆蛋白粉 甘肃张掖新乐超市。
V-1200型可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；TDL-50大容量低速离心机金坛市亿能实验仪器场；LGJ-18真空冷冻干燥机 北京松源华科技发展有限公司； RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KQ-250B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；L-8900氨基酸分析测定仪 日本日立公司；氨基酸柱 安米诺西斯公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 菌丝体中蛋白质的提取工艺
荷叶离褶伞菌丝体→活化→加硒→摇瓶发酵→加入20 L发酵罐→发酵→得到富硒菌丝体→干燥→粉碎→加碱液搅拌→超声辅助提取→离心→上清液→调节pH直至等电点→离心→回溶→冷冻干燥→蛋白样品
操作要点：在20 L生物发酵罐中加入玉米粉和大豆蛋白粉水解液的培养基，灭菌冷却后接入8.5%种子液（将活化的荷叶离褶伞菌丝体菌块接入PDA培养基中，在摇床发酵8 d的发酵液），发酵至第3 d，在发酵液中加入Na2SeO3溶液，使发酵液中硒含量为4 μg/mL，待发酵至第8 d时，终止发酵，过滤并清洗菌丝体，放入真空干燥机中干燥，磨粉制成100目标准粉[12]，称取0.5 g该标准粉，加入浓度为0.05 mol/L NaOH溶液，使用超声辅助提取后，然后在3000 r/min转速下离心15 min，然后调节上清液至等电点，再次离心得蛋白沉淀，最后将蛋白沉淀加入少量蒸馏水调节至pH7.0回溶。放在真空冷冻干燥机中干燥得蛋白样品。
1.2.2 蛋白质等电点的测定
按照文献[13]方法测定蛋白质等电点，略作修改。将富硒荷叶离褶伞菌丝体与0.05 mol/L的NaOH溶液以55:1液料比进行混合，置于磁力搅拌器中53 ℃提取2 h，冷却至室温后离心（3000 r/min，15 min）取上清液。分别取30 mL上清液于8个50 mL的烧杯中，分别用1 mol/L的 HCl溶液调节pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，室温下静置2 h后离心（8000 r/min，10 min），测定上清液蛋白质含量。
1.2.3 蛋白提取率的测定
按照文献[14]中双缩脲法测定蛋白质的提取率。
1.2.3.1 蛋白质标准品溶液
准确称取1.0 g牛血清白蛋白，用水配制成含量为10 mg/mL的标准蛋白溶液，分别取出0、1、2、3、4和5 mL，转入6支比色管，各加入20 mL双缩脲试剂，并分别加水补足到25 mL，室温下反应30 min，以蒸馏水为空白，于550 nm测定吸光度值，然后以蛋白质含量为横坐标（mg/mL），吸光值为纵坐标，得回归方程Y=0.1985X+0.0665，决定系数R2=0.9990。
1.2.3.2 样品中蛋白质提取率的测定
取5 mL超声提取后离心的上清液，加入20 mL双缩脲试剂，并加水补足到25 mL，充分混匀后，室温下放置30 min，在550 nm下测定吸光值。
式中，C：从标准曲线查得样品的吸光值所对应的蛋白质浓度（mg/mL）；V1：反应体系的总体积（mL）；V2：用于显色的样品体积（mL）；V0：样品稀释后总体积（mL）；m：样品中蛋白质（由等电点处沉淀的蛋白质冻干所得）的质量（g）。
1.2.4 富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白提取单因素实验
1.2.4.1 提取温度对蛋白提取率的影响
准确称取富硒的样品0.5000 g，选择不同提取温度（50、60、70和80 ℃），碱液浓度为0.05 mol/L，液料比为150:1 g/mL，提取时间为20 min，提取1次的条件下超声搅拌提取，提取后在3000 r/min下离心15 min，测定蛋白质含量，研究提取时间对菌丝体蛋白提取率的影响。
1.2.4.2 提取时间对蛋白提取率的影响
准确称取富硒的样品0.5000 g，在1.2.3.1最优提取温度下，选择不同提取时间（20、40、60、80和100 min），碱液浓度为0.05 mol/L，液料比为150:1 g/mL，提取时间为60 min，提取次数为1次的条件下超声搅拌提取，提取后在3000 r/min下离心15 min，测定蛋白提取率，研究提取时间对菌丝体蛋白提取率的影响。
1.2.4.3 液料比对蛋白提取率的影响
准确称取富硒的样品0.5000 g，选择1.2.3.1中最优提取时间，在60 ℃水浴中，碱液浓度为0.05 mol/L，选择不同液料比（150:1、200:1、250:1、300:1和400:1 g/mL），提取1次的条件下超声搅拌提取，提取后在3000 r/min下离心15 min，测定蛋白提取率，研究液料比对菌丝体蛋白提取率的影响。
1.2.4.4 提取次数对蛋白提取率的影响
准确称取富硒的样品0.5000 g，选择最优提取时间、液料比和提取温度，在不同提取次数（1、2、3和4次）下，于0.05 mol/L碱液中超声搅拌提取，提取后在3000 r/min下离心15 min，测定蛋白提取率，研究提取时间对菌丝体蛋白提取率的影响。
1.2.5 富硒菌丝体中蛋白质提取工艺的响应面试验
根据单因素实验结果，运用Design-expert 8.0软件系统，采用Box-Behnken响应面设计法[15]，以蛋白提取率为响应值，选取提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）和提取次数（D）四个因素，设计4因素3水平试验，因素水平表见表1。
表 1 响应面试验因素与水平设计Table 1. Factors and levels of response surface methodology因素 编码 变量水平 −1 0 1 提取温度（℃） A 50 60 70 提取时间（min） B 50 60 70 液料比（mL/g） C 150:1 200:1 250:1 提取次数 D 1 2 3 1.2.6 蛋白样品中硒含量测定 根据文献[16]方法稍作修改测定蛋白样品中硒含量。
1.2.6.1 硒标准曲线的绘制
精确称取0.10 g硒标准品溶解于2 mL浓硝酸中，低温下（65~70 ℃）加热溶解至蒸干，用体积比为1:1的浓盐酸溶解，定容至1 L，使用时用蒸馏水稀释至1 μg/mL制得硒标准溶液。准确吸取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mL的硒标准溶液（1.0 μg/mL），分别置于125 mL分液漏斗中，加水定容至25 mL，分别加入5% EDTA-2Na溶液1 mL，用体积比为1:1的浓HCl调节溶液至pH2~3，再加入0.5% 3,3'-二氨基联苯胺溶液4 mL，摇匀，置暗处20 min后，用10% NaOH溶液调节至pH7~7.5，加入10 mL甲苯振荡2 min静置分层，弃水层，甲苯层用比色皿于420 nm处测其吸光值。以硒含量（μg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程为Y=0.0151X−0.0014，决定系数R2=0.9996。
1.2.6.2 样品的处理及硒含量测定
准确称取0.05 g样品溶于2 mL浓硝酸，在电热炉中加热（控制温度160～180 ℃）消化，至样品完全溶解，溶液呈澄清，停止加热并冷却至70 ℃，加入体积比为1:1浓HCl定容至10 mL，备用。准确移取上述备用溶液0.2 mL，用水定容至25 mL转入125 mL分液漏斗中，此时若有白色沉淀物（可能是硅胶）应用滤纸过滤，分别加入5% EDTA-2Na溶液1 mL后步骤同1.2.6.1中标准曲线的制作方法。根据样品溶液测得的吸光值，结合硒标准曲线查找、计算相应的硒含量。
式中，C：从标准曲线查得样品的吸光值所对应的硒浓度（mg/mL）；V1：反应体系的总体积；n：样品稀释倍数；m：菌丝体样品中蛋白质的质量（g）。
1.2.7 富硒菌丝体中蛋白质氨基酸种类和含量测定
1.2.7.1 蛋白样品的前处理
称取提取的蛋白质0.1000 g置于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L的盐酸，将封口严密的水解管放在（110±1）℃的恒温干燥箱内水解22 h后，取出冷却。打开水解管，将水解液全部转入25 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，取滤液1 mL置于25 mL小烧杯中，在40～50 ℃的真空干燥箱中烘干（如有残留物，用1～2 mL去离子水溶解，再干燥），加入5 mL 0.02 mol/L的盐酸溶液溶解作为待测液。
1.2.7.2 测定分析条件
氨基酸柱；单样品分析周期为30 min。分离柱的条件为：洗脱液的流速0.40 mL/min，柱温70 ℃，柱压8.627 MPa；反应柱的条件为：茚三酮及茚三酮缓冲液的流速0.35 mL/min，柱温135 ℃，柱压0.982 MPa，检测波长：440 nm/570 nm双波长同时检测；反应温度：135 ℃；分别取标准溶液及试样20 μL进样[17]。
1.2.8 营养价值评价
采用化学评分（chemical score，CS）、氨基酸评分（amino acid score，AAS）对富硒荷叶离褶伞菌丝体进行营养价值评价[18]。
1.3 数据处理
实验中的每组数据均为3次重复的平均值，采用Design-Expert 13软件进行响应面设计和统计结果分析，采用Origin 2018进行图表处理。
2. 结果与分析
2.1 蛋白质等电点的确定
如图1所示，上清液中蛋白质的含量，随着pH增加呈现凹形，pH从2.5~3.5，随着pH增加，上清液中蛋白质含量在急剧降低，从3.5以后开始又缓慢增加，4.5以后迅速增加，在5.0时达到最大值22.5%。说明提取液上清中蛋白质在pH3.5~4.5的溶解度较低，在此范围之外，蛋白含量均较大。pH在3.5~4.5范围内，上清液中蛋白质残留浓度较低，而在3.5处蛋白质所带电荷为零，溶解度最低，推测富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质的等电点在3.5左右，这和王梓杭等[18]对香菇中蛋白质的提取工艺中等电点的测定值（3.8）相接近。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 提取温度对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
如图2所示，随着提取温度的升高，蛋白提取率也在增加，提取温度越高，碱提效果也越好。但提取温度超过60 ℃以后，蛋白提取率随提取温度变化的趋势减小，并且有文献[19]报道，蛋白的变性温度为70~80 ℃，由此确定实际提取温度为60 ℃。这与田敏爵等[20]对富硒猴头菌中硒蛋白提取工艺的研究中的结论相似。
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图 2 提取温度对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响Figure 2. Effect of extraction temperature on protein extraction rate in selenium-rich mycelia2.2.2 提取时间对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
如图3所示，随提取时间的增加，蛋白提取率不断增加，在提取时间为60 min时，达到最大43.69%。提取时间超过60 min后，随着提取时间延长，蛋白提取率呈现缓慢下降趋势，可能是提取时间增加后，蛋白质溶出量已饱和，因此选择60 min为优化试验条件。
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图 3 提取时间对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响Figure 3. Effect of reaction time on protein extraction rate in selenium-rich mycelia2.2.3 液料比对对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
由图4可知，随着液料比的增大，蛋白质提取率也在增加，液料比200:1 mL/g时达到44.95%，之后随液料比的增加，蛋白质提取率的提高不明显。可能是因为随着溶剂的增加，固液相中的浓度差增大，溶质溶出速度增大[21]，使得蛋白提取率增加。但是液料比过大会给随后的浓缩步骤造成负担，考虑工艺过程中溶剂使用量和降低生产成本方面的考虑，确定液料比为200:1 mL/g。
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图 4 液料比对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响Figure 4. Effect of liquid to material ratio on protein extraction rate in selenium-rich mycelia2.2.4 提取次数对对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
由图5可知，随着提取次数增多，蛋白提取率增加，碱提2次的蛋白提取率为61.39%，之后随着提取次数增加，蛋白提取率增加幅度缓慢，说明碱提2次可以有效地将蛋白充分提出，考虑到提取效率，选择2次为最佳提取次数。
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图 5 提取次数对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响Figure 5. Effect of reaction times on protein extraction rate in selenium-rich mycelia2.3 响应面试验结果
根据Box-Behnken的中心组合设计原理，试验中对4因素各取3水平，设计了29个试验点的响应面分析试验，结果见表2。经Design-Expert统计分析软件进行多元回归分析，所得的方差分析结果见表3。
表 2 响应面试验设计和结果Table 2. Design and results of response surface analysis实验号 因素 Y1蛋白提取率（%） A
提取温度B
提取时间C
液料比D
提取次数1 1 −1 0 0 66.99 2 0 −1 0 −1 19.41 3 0 −1 −1 0 46.12 4 0 1 0 1 54.80 5 0 0 0 0 78.58 6 −1 0 0 1 51.84 7 0 0 −1 1 65.32 8 −1 0 1 0 54.37 9 1 0 −1 0 59.01 10 0 −1 0 1 52.52 11 −1 0 −1 0 39.47 12 0 0 0 0 77.44 13 0 0 0 0 71.84 14 0 0 0 0 70.44 15 0 1 1 0 57.22 16 1 1 0 0 62.23 17 0 1 −1 0 49.82 18 1 0 0 1 67.37 19 −1 −1 0 0 49.33 20 −1 1 0 0 50.02 21 1 0 1 0 51.64 22 0 0 1 1 52.58 23 0 0 0 0 72.85 24 0 0 −1 −1 30.24 25 0 1 0 −1 34.85 26 0 −1 1 0 62.76 27 0 0 1 −1 41.13 28 −1 0 0 −1 22.74 29 1 0 0 −1 44.80 表 3 响应面试验的方差分析结果Table 3. ANOVA results of factors and model in the response surface experiment来源 平方和 由由度 均方 F值 P值 显著性 模型 6002.31 14 428.74 13.42 <0.0001 ** A 591.79 1 591.79 18.53 0.0007 ** B 11.62 1 11.62 0.36 0.5560 C 73.61 1 73.61 2.30 0.1512 D 1906.63 1 1906.63 59.70 <0.0001 ** AB 7.43 1 7.43 0.23 0.6371 AC 123.99 1 123.99 3.88 0.068 AD 10.66 1 10.66 0.33 0.5726 BC 21.34 1 21.34 0.67 0.4273 BD 43.30 1 43.30 1.36 0.2638 CD 139.59 1 139.59 4.37 0.0553 A2 534.74 1 534.74 16.74 0.0011 ** B2 756.18 1 756.18 23.68 0.0002 ** C2 694.29 1 694.29 21.74 0.0004 ** D2 2430.15 1 2430.15 76.09 <0.0001 ** 残差 447.13 14 31.94 失拟项 395.93 10 39.59 3.09 0.1439 纯误差 51.21 4 12.8 总差 6449.44 28 注：*表示P<0.05达到差异显著水平；**表示P<0.01达到差异极显著水平。 利用软件Design Expert8.0对实验结果进行分析得到多元二次回归方程：Y1=74.23+7.02A+0.98B+2.48C+12.61D−1.36AB−5.57AC−1.63AD−2.31BC−3.29BD−5.91CD−9.08A2−10.80B2−10.35C2−19.36D2。
由表3可知，模型项显著，P<0.0001，失拟项不显著，P=0.1439>0.05，决定系数R2=0.9307，说明模型可用，回归拟合程度较好。A、D、A2、B2、C2、D2对响应值的影响均达到极显著水平（P<0.01），B、C、AB、AC、AD、CD、BD、BC对响应值的影响均不显著。由F值可知，影响蛋白提取率主要因素依次为D>A>C>B，即提取次数>提取温度>液料比>提取时间。利用Design Expert 8.0软件可以得两两因子交互作用的响应面图。响应面坡面的陡峭程度及等高线的疏密、形状可反映出交互作用对响应值影响的强弱，响应面坡度陡峭，等高线密集且趋于椭圆表示两因素交互作用对响应值的影响显著，而响应面坡度平缓，等高线稀疏且趋于圆形则与之相反。图6反映两因素交互作用对富硒荷叶离褶伞中蛋白提取率的影响，图中响应面坡度较平缓，等高线稀疏且趋于圆形，说明提取时间、提取温度、提取次数和液料比的两两交互作用对蛋白质提取率影响不显著，这与方差分析结果一致。
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图 6 各因素交互作用对富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白提取率的响应面图Figure 6. Response surface of the interaction of various factors on the protein extraction rate of selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia2.4 验证试验
Design-Expert 8.0统计分析软件进行数据分析，得到荷叶离褶伞菌丝体硒蛋白的最佳提取工艺条件：提取温度63.81 ℃、提取时间59.80 min、液料比196.36:1 g/mL、提取次数2.32次，理论上蛋白提取率为77.50%。考虑到实验的可行性，将最佳条件调整为提取温度64 ℃、提取时间60 min、液料比200:1 g/mL、提取次数2次。在此条件下，对荷叶离褶伞菌丝体硒蛋白进行提取，通过3次平行试验，测得蛋白提取率为75.13%，相对误差为2.36%，证明优化的荷叶离褶伞菌丝体硒蛋白的最适提取工艺条件可行，这与王莲芳等[22]研究富硒食用菌中蛋白得率为30.17%的结果不同，在优化条件相同的同等条件下，未富硒菌丝体中蛋白质提取率为52.11%，说明未富硒菌丝体中含有的蛋白含量低，富硒能够提高菌丝体中的蛋白质含量[23]。
2.5 富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中硒含量测定
富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白中硒含量为63.87±4.18 μg/g。推测荷叶离褶伞菌丝体发酵过程中加入无机硒，可以通过生物转化进入蛋白质中。
2.6 富硒菌荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中氨基酸色谱分析
实验所测得氨基酸混合标准品的色谱图见图7，17种氨基酸在选定的分离条件下，可以达到很好的分离效果。荷叶离褶伞菌丝体富硒前后的蛋白质中均含有14种氨基酸（色氨酸在水解过程中遭到破坏），Cys和Lie两种氨基酸含量未检出。富硒后菌丝体蛋白质中的氨基酸，除Pro外，其他氨基酸含量均比未富硒菌丝体中含量高，其中Ala和Lys两种氨基酸含量较未富硒的菌丝体中含量高出一倍以上（表4）。
表 4 富硒前后荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中氨基酸组成及含量Table 4. Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment氨基酸种类 未富硒菌丝体
蛋白质中氨基酸
含量（g/100 g）富硒后菌丝体
蛋白质中氨基酸
含量（g/100 g）增加量
（%）Asp 5.03 5.39 7.16 Thr* 2.41 2.75 13.76 Ser 1.84 2.36 28.58 Glu 6.53 7.82 19.78 Pro 4.55 4.05 −11.04 Gly 2.77 3.07 10.78 Ala 3.11 5.00 60.98 Cys 0.00 0.00 0.00 Val* 3.22 3.49 8.62 Met* 0.92 0.97 4.96 Ile* 0.00 0.00 0.00 Leu* 3.95 5.21 31.79 Tyr 1.00 1.59 58.16 Phe* 2.60 2.69 3.68 Lys* 1.26 2.09 65.62 His 0.97 1.33 36.89 Arg 2.38 3.38 42.05 氨基酸总量
（TAA）42.53 51.18 20.33 必需氨基酸含量
（EAA）14.36 17.20 19.75 非必需氨基酸含量
（NEAA）28.17 33.98 EAA/NEAA 0.51 0.51 注：*号表示人体必需氨基酸。 富硒菌丝体蛋白中总氨基酸含量（TAA）和人体必需氨基酸的含量（EAA）分别为51.18和17.20 g/100 g，较未富硒中的含量高出20.33%和19.75%，EAA/TAA的值为33.61，EAA/NEAA的值为0.51，与FAO/WHO提出的理想蛋白的标准进行判断，荷叶离褶伞菌丝体富硒前后蛋白接近该标准，说明荷叶离褶伞菌丝体富硒前后均具有一定的营养价值，且硒能促进荷叶离褶伞菌丝体中大部分氨基酸的合成，这和富硒姬松茸[24]、松杉灵芝[25]菌丝体蛋白质中氨基酸含量变化的研究结果一致。
由表4可知，富硒荷叶离褶伞菌丝体中必需氨基酸的含量为33.61%，和不富硒的菌丝体中必需氨基酸含量相当。由表5可知，必需氨基酸Thr、Leu、Phe+Tyr占总氨基酸的质量分数比FAO/WHO提出的理想蛋白标准的高，Lys和Met+Cys的质量分数比标准低。CS越接近100分，表明样品与鸡蛋蛋白越接近；AAS越接近100分，表明样品与WHO/FAO模式蛋白越接近。Lys、Phe+Tyr和Met+Cys的CS较低，其他必需氨基酸均在80分以上，因此荷叶离褶伞菌丝体蛋白的限制性氨基酸为Lys、Phe+Tyr和Met+Cys；Lys和Met+Cys的AAS较低，其他必需氨基酸均超过100，说明菌丝体具有良好的营养价值，且富硒菌丝体的营养价值更高一些。
表 5 富硒前后荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中必需氨基酸组成评价Table 5. Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment必需氨基酸种类 占总氨基酸的质量分数（%） FAO/WHO
参考值（%）CS AAS 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 Thr 6.00 5.75 4.0 86.61 83.07 150.05 143.75 Leu 9.84 10.90 7.0 111.80 123.86 140.54 155.72 Val 8.0 7.30 5.0 110.93 100.99 160.40 146.00 Lys 3.14 4.37 5.5 49.03 68.31 51.95 72.35 Ile 0.00 0.00 4.0 0 0 0 0 Phe+Tyr 8.97 8.95 6.0 60.38 60.30 149.43 149.17 Met+Cys 2.29 2.03 3.5 41.66 36.90 65.46 58.00 3. 结论
该研究采用目前在食用菌蛋白质提取中常采用的超声辅助碱提取蛋白法，通过单因素实验和Box-benhnken中心组合响应面试验法，对富硒荷叶离褶伞菌丝体中蛋白质进行了优化试验，确定了最佳提取工艺条件：提取时间60 min、提取温度60 ℃、液料比200:1 g/mL、提取次数为2次，蛋白提取率为76.90%。并且采用3,3’-二氨基联苯胺分光光度法测定菌丝体蛋白质中的硒含量为63.87 μg/g，通过添加无机硒进行发酵生产菌丝体，可以使硒进入菌丝体蛋白中。分析发现，富硒菌丝体中有17种氨基酸，其中必需氨基酸含量占33.61%，和非必需氨基酸的比值为0.5，氨基酸组成较为合理，荷叶离褶伞菌丝体富硒前后均具有很高的营养价值，富硒的营养价值更高，是一种优质的蛋白来源，且其中含有一定量的硒，大大提高菌丝体的营养价值和利用价值，这为富硒荷叶离褶伞菌丝体的进一步开发利用提供了可靠的理论依据，具有广阔的应用前景。
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图 2 提取温度对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
Figure 2. Effect of extraction temperature on protein extraction rate in selenium-rich mycelia
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图 3 提取时间对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
Figure 3. Effect of reaction time on protein extraction rate in selenium-rich mycelia
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图 4 液料比对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
Figure 4. Effect of liquid to material ratio on protein extraction rate in selenium-rich mycelia
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图 5 提取次数对富硒菌丝体中蛋白提取率的影响
Figure 5. Effect of reaction times on protein extraction rate in selenium-rich mycelia
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图 6 各因素交互作用对富硒荷叶离褶伞菌丝体蛋白提取率的响应面图
Figure 6. Response surface of the interaction of various factors on the protein extraction rate of selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia
表 1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
因素 编码 变量水平 −1 0 1 提取温度（℃） A 50 60 70 提取时间（min） B 50 60 70 液料比（mL/g） C 150:1 200:1 250:1 提取次数 D 1 2 3 
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表 2 响应面试验设计和结果
Table 2 Design and results of response surface analysis
实验号 因素 Y1蛋白提取率（%） A
提取温度B
提取时间C
液料比D
提取次数1 1 −1 0 0 66.99 2 0 −1 0 −1 19.41 3 0 −1 −1 0 46.12 4 0 1 0 1 54.80 5 0 0 0 0 78.58 6 −1 0 0 1 51.84 7 0 0 −1 1 65.32 8 −1 0 1 0 54.37 9 1 0 −1 0 59.01 10 0 −1 0 1 52.52 11 −1 0 −1 0 39.47 12 0 0 0 0 77.44 13 0 0 0 0 71.84 14 0 0 0 0 70.44 15 0 1 1 0 57.22 16 1 1 0 0 62.23 17 0 1 −1 0 49.82 18 1 0 0 1 67.37 19 −1 −1 0 0 49.33 20 −1 1 0 0 50.02 21 1 0 1 0 51.64 22 0 0 1 1 52.58 23 0 0 0 0 72.85 24 0 0 −1 −1 30.24 25 0 1 0 −1 34.85 26 0 −1 1 0 62.76 27 0 0 1 −1 41.13 28 −1 0 0 −1 22.74 29 1 0 0 −1 44.80
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表 3 响应面试验的方差分析结果
Table 3 ANOVA results of factors and model in the response surface experiment
来源 平方和 由由度 均方 F值 P值 显著性 模型 6002.31 14 428.74 13.42 <0.0001 ** A 591.79 1 591.79 18.53 0.0007 ** B 11.62 1 11.62 0.36 0.5560 C 73.61 1 73.61 2.30 0.1512 D 1906.63 1 1906.63 59.70 <0.0001 ** AB 7.43 1 7.43 0.23 0.6371 AC 123.99 1 123.99 3.88 0.068 AD 10.66 1 10.66 0.33 0.5726 BC 21.34 1 21.34 0.67 0.4273 BD 43.30 1 43.30 1.36 0.2638 CD 139.59 1 139.59 4.37 0.0553 A2 534.74 1 534.74 16.74 0.0011 ** B2 756.18 1 756.18 23.68 0.0002 ** C2 694.29 1 694.29 21.74 0.0004 ** D2 2430.15 1 2430.15 76.09 <0.0001 ** 残差 447.13 14 31.94 失拟项 395.93 10 39.59 3.09 0.1439 纯误差 51.21 4 12.8 总差 6449.44 28 注：*表示P<0.05达到差异显著水平；**表示P<0.01达到差异极显著水平。
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表 4 富硒前后荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中氨基酸组成及含量
Table 4 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment
氨基酸种类 未富硒菌丝体
蛋白质中氨基酸
含量（g/100 g）富硒后菌丝体
蛋白质中氨基酸
含量（g/100 g）增加量
（%）Asp 5.03 5.39 7.16 Thr* 2.41 2.75 13.76 Ser 1.84 2.36 28.58 Glu 6.53 7.82 19.78 Pro 4.55 4.05 −11.04 Gly 2.77 3.07 10.78 Ala 3.11 5.00 60.98 Cys 0.00 0.00 0.00 Val* 3.22 3.49 8.62 Met* 0.92 0.97 4.96 Ile* 0.00 0.00 0.00 Leu* 3.95 5.21 31.79 Tyr 1.00 1.59 58.16 Phe* 2.60 2.69 3.68 Lys* 1.26 2.09 65.62 His 0.97 1.33 36.89 Arg 2.38 3.38 42.05 氨基酸总量
（TAA）42.53 51.18 20.33 必需氨基酸含量
（EAA）14.36 17.20 19.75 非必需氨基酸含量
（NEAA）28.17 33.98 EAA/NEAA 0.51 0.51 注：*号表示人体必需氨基酸。
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表 5 富硒前后荷叶离褶伞菌丝体蛋白质中必需氨基酸组成评价
Table 5 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment
必需氨基酸种类 占总氨基酸的质量分数（%） FAO/WHO
参考值（%）CS AAS 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 未富硒菌丝体蛋白 富硒菌丝体蛋白 Thr 6.00 5.75 4.0 86.61 83.07 150.05 143.75 Leu 9.84 10.90 7.0 111.80 123.86 140.54 155.72 Val 8.0 7.30 5.0 110.93 100.99 160.40 146.00 Lys 3.14 4.37 5.5 49.03 68.31 51.95 72.35 Ile 0.00 0.00 4.0 0 0 0 0 Phe+Tyr 8.97 8.95 6.0 60.38 60.30 149.43 149.17 Met+Cys 2.29 2.03 3.5 41.66 36.90 65.46 58.00
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