Study on the in Vitro Digestion Characteristics of Polysaccharides Emulsion from Clinacanthus nutans
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摘要: 本实验主要考察忧遁草多糖（Clinacanthus nutans polysaccharide，CNP-P2）作为乳化剂稳定乳液的体外消化特性及其负载虾青素（Astaxanthin，AST）递送体系的能力，旨在为C. nutans加工及其在食品中的应用提供理论与方法指导。本研究以阿拉伯胶（Gum Arabic，GA）为对照，通过液滴大小、Zeta电位、微观结构和FFA释放量来评价CNP-P2乳液体外胃肠道消化行为。结果表明，CNP-P2乳液在模拟胃消化中能保持稳定。CNP-P2乳液的游离脂肪酸（Free Fatty Acid，FFA）释放量为32.41%，GA乳液的最终释放量为31.68%。构建负载AST的CNP-P2乳液递送体系，评价其稳定AST的能力和生物可及性。CNP-P2乳液能较好地保留紫外光照射下AST的含量，胃肠消化时FAA释放量为27.22%，生物可及性为44.43%±1.63%，CNP-P2乳液能够显著提高大豆油（2.5%）中AST的生物可及性（P<0.05）。基于以上结果，有效延缓脂质消化的前提下，利用CNP-P2制备的慢消化乳液能有效递送AST。Abstract: This study aimed to investigate in vitro digestion characteristics of emulsion stabilized use Clinacanthus nutans polysaccharide (CNP-P2) as an emulsifier and its ability to support the astaxanthin (AST) delivery system, providing theoretical and methodological guidance for the processing of C. nutans and its application in food. The gastrointestinal behavior of CNP-P2 emulsion was evaluated by droplet size, Zeta potential, microstructure, and FFA release in a controlled experiment using Gum acacia (GA). The results showed that CNP-P2 emulsion could remain stable in the stomach stage with a free fatty acid (FAA) release of 32.41%, and the final release of GA emulsion was 31.68%. A CNP-P2 emulsion delivery system loaded with AST was constructed to evaluate its ability and bioaccessibility for astaxanthin (AST) stabilization. CNP-P2 emulsion could retain AST content well under ultraviolet irradiation, with an FAA release of 27.22% during gastrointestinal digestion and a bioaccessibility of 44.43%±1.63%. CNP-P2 emulsion could significantly improve the bioaccessibility of AST in soybean oil (2.5%) (P<0.05). Based on the above results, under the premise of effectively delaying lipid digestion, the slow digestion emulsion prepared by CNP-P2 can effectively deliver astaxanthin.
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忧遁草（Clinacanthus nutans）是海南的一种特色植物饮品，已被证实具有抗炎、抗病毒、抗氧化和降血糖等多种生理活性作用，具有非常重要的经济价值，对其进行精深加工和营养功能评价具有重要意义[1-2]。乳液是由至少两种不混溶相（分散相和连续相）组成的多相体系[3-4]，被广泛应用于乳制品、调味品、甜点、酱汁、蘸酱和饮料等食品加工中[5]。多糖以来源广泛、资源丰富、可再生等优点已经成为乳液稳定剂的首选之一[6-8]。
人体通过食物摄入活性成分并从食物基质中释放，在胃肠道液中稳定后，通过上皮细胞吸收进入体循环，在体循环中发挥其生物活性。食品中的生物活性成分要想保持其促进健康的作用，就必须在加工、储存和运输过程中保持稳定，摄入后，它们必须从食物基质中释放出来，在胃肠道液中稳定，通过上皮细胞吸收，然后进入体循环，在体循环中发挥其生物活性[9]。乳液已被证明是出色的脂基输送系统，可改善亲脂性生物活性化合物的疏水性性、稳定性和功能性[10-12]。脂质在人体的消化和吸收主要发生在胃和小肠，乳液进入胃后，胃脂肪酶会吸附在脂滴的油水界面处启动三酰基甘油（Ttriacylglycerol，TAG）的水解，主要形成二酰基甘油（Diacylglycerol，DAG）和非无菌脂肪酸。接着在小肠阶段，胆盐吸附在油水界面并在脂肪酶-脂肪酶复合物的作用下分解界面，同时与脂质消化产生的FFA和单酰基甘油（Monoacylglycerol，MAG）形成混合胶束，活性成分溶解在胶束通过黏液层迁移到肠腔表面，被上皮细胞所吸收[13-14]。其中，乳液的脂质相组成、界面性质和粒径会影响其在小肠中混合胶束的形成和增溶能力，从而影响乳液脂质的生物利用度[15-16]。此外，脂溶性活性成分在油相中的高溶解度会增强乳液的负载能力和生物利用度，这可以增强生物活性物质在粘液层和上皮上的渗透性[17-18]。尽管如此，乳液仍然存在一些需要改进的缺点。乳液的稳定性很容易受到温度变化和不利胃肠道环境的影响[19]。乳液中的脂质因大表面积增加了与氧气接触的机会，很容易降解为脂质氢过氧化物甚至丙二醛[20]，这会进一步影响生物活性物质的生物利用度。此外，乳液的高脂质消化率可能导致能量摄入过多和健康危害。已有研究表明大豆蛋白纳米颗粒具有调控脂质消化进程的潜力[21]。耿春阳[22]的研究也表明在有效延缓脂质消化的前提下，利用高良姜多糖能有效递送高良姜黄酮。低甲酯化果胶诱导的乳液凝胶可以很好地抑制FFAs的释放和油脂消化，在消化过程中显示出潜在的姜黄素递送能力[23]。因此，寻找一种可延缓脂质消化从而控制热量摄入的天然的乳化剂具有广阔的应用前景。
实验室前期以C. nutans中提取的多糖组分为原料，证实忧遁草多糖（Clinacanthus nutans polysaccharide，CNP-P2）具有良好的乳化活性剂乳化稳定性。基于此，通过制备水包油乳液和负载虾青素（AST）乳液来模拟体外胃肠道消化环境，通过液滴大小、Zeta电位、微观结构和FFA释放量等指标探究其体外消化特性及其负载AST递送体系的能力，旨在为C. nutans加工及其在食品中的应用提供理论与方法指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
忧遁草干叶 2022年5月采自海南省五指山市，经海南大学食品科学与工程学院张伟敏教授鉴定为忧遁草（Clinacanthus nutans）干叶；大豆油 金龙鱼有限公司；胃蛋白酶（酶活力≥800 U/mg） 上海酶联生物科技有限公司；胰酶（4000 U/g） 赛默飞（中国）有限公司；猪胆盐 普洛麦格（北京）生物技术有限公司；丙酮 AR，上海碧云天生物科技有限公司；AST（95%） 西安凯康生物科技有限公司；阿拉伯树胶（Gum Arabic，GA） 上海酶联生物科技有限公司；叠氮化钠 国药集团化学试剂公司。
IKA T18高速剪切乳化机 上海达平仪器有限公司；NanoGenizer 30 k高压微射流均质机 微流纳米生物科技有限公司；Zetasizernano ZS 90激光粒度分析仪 英国Malvern公司；Master-sizer 3000激光衍射粒度仪 英国Malvern公司；BSA124S-CW电子天平 赛多利斯科技仪器有限公司；Z326K高速落地离心机 德国HERMLE公司；MQL-61R恒温摇床 上海昱泉仪器有限公司；LEICA DFC 450 C生物倒置显微镜 德国徕卡公司。
1.2 实验方法
1.2.1 忧遁草多糖的制备
在前人研究的基础上对C. nutans多糖的提取方法进行了改进[22-23]，将干燥的忧遁草叶粉碎，通过40目筛，将草粉与80%乙醇按1:20（w/v）的比例混合，在30 ℃条件下用磁力搅拌器以500 r/min搅拌12 h，以去除大部分多酚和单糖。去除杂质后，草粉残渣在50 ℃下干燥至恒重，然后在70 ℃下按1:20（w/v）热水提取3次，每次60 min。将水提液减压浓缩至原溶液的1/6，加入3倍无水乙醇进行沉淀，4 ℃放置24 h，3000 r/min离心10 min，收集沉淀物。乙醇沉淀溶于蒸馏水，5%活性炭脱色，过滤，10000 Da透析袋透析，冷冻干燥得到忧遁草粗多糖（CNP）。再通过DEAE Sepharose Fast Flow和全自动凝胶纯化等方法，分离纯化出多糖CNP-P2。
1.2.2 乳液的制备
将2% CNP-P2和2% GA溶解在磷酸缓冲液（PBS，10 mmol/L，pH7.0）中，并以92:8（w/w）的水相和油相添加大豆油。用低通量均质乳化剂（T18数字）将混合物剪切3 min（2000 r/min），形成初级乳液。使用高压微射流均质器（Nano Genizer 30 k）在12000 psi的压力下将原油乳化液均质三次。所有操作在冰浴中进行，防止脂类氧化。最后加入叠氮化钠（0.02% w/v）防止微生物生长。
1.2.3 乳液粒径的测定
采用Mastersizer 3000激光衍射粒度仪中的动态光散射（DLS）技术对乳液的MPD（d3,2）和粒径分布进行了测量。在测量之前，将乳液样品轻轻摇晃和混合，并将其滴入含有分散剂（蒸馏水）的测量池中，使所需的遮光率满足测试要求。仪器参数设置为连续相折射率为1.330，色散相折射率为1.470，泵速为2500 r/min超声频率为70%。所有试验均在此条件下进行并重复3次。
1.2.4 乳液Zeta电位的测定
用Zetasizernano ZS 90激光粒度分析仪测量了乳液中液滴的Zeta电位。在测试之前，将样品摇匀并稀释到一定次数，以满足测量标准。样品在25 ℃下测量，平行取三次平均，表示为均数±偏差。
1.2.5 微观结构的测定
使用徕卡生物倒置显微镜来观察，目镜10倍，物镜40倍。
1.2.6 CNP-P2乳液的胃肠道行为研究
1.2.6.1 CNP-P2界面抗胆盐吸附实验方法
参照耿春阳[24]的方法，用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）配制成胆盐母液，将新鲜乳液与盐溶液按比例混合均匀，使混合溶液中的胆盐浓度为0~25 mg/mL，将混合溶液置于37 ℃恒温摇晃2 h（转速为120 r/min）。反应结束后测定乳液的Zeta电势。
1.2.6.2 模拟体外胃肠道消化实验方法
分别将2%的CNP-P2和GA作为乳化剂，按步骤1.2.2制备乳液。因乳液在口腔停留的时间短，用一个包含胃-肠阶段的体外模拟消化模型来进行体外模拟消化，通过液滴大小、Zeta电位、微观结构和FFA释放量来评价其胃肠道行为。此法参照Hu等[25-26]的方法略作修改。
胃消化阶段：将0.5 g氯化钠和1.75 mL浓盐酸（12 mol/L）溶解至蒸馏水中，并定容至250 mL，放置冰箱待用。每次使用前将溶液加热至37 ℃，加入0.8 g胃蛋白酶，充分分散后得到模拟胃液（SGF）。
取20 mL的CNP-P2乳液与SGF等体积混合并用1 mol/L的氢氧化钠调节混合物的pH至2.0，再将其放至温度设置为37 ℃，速度为120 r/min的恒温摇床中，模拟胃消化1 h。
肠消化阶段：将胆盐（10 mg/mL）与磷酸盐缓冲液（5 mmol/L，pH7.0）在室温下连续搅拌过夜制备胆盐溶液。肠期反应前30 min制备胰酶溶液（24 mg/mL），将粉状胰酶与磷酸盐缓冲液（5 mmol/L，pH7.0）混合。使用前将其在水浴（37 ℃）中孵育。
模拟胃消化阶段结束后，立即用1 mol/L的氢氧化钠调节混合物的pH至7.0，然后依次加1.5 mL的氯化钠（3.8 mol/L）溶液、氯化钙（0.25 mol/L）溶液，3.5 mL的胆盐溶液以及2 mL的胰酶溶液。此过程，混合物一直放置在加热式集热磁力搅拌器中保持37 ℃，以减少实验误差。最后将其放置恒温摇床中，模拟肠消化2 h。
在模拟消化不同阶段测定其Zeta电位、粒径和微观结构。
1.2.6.3 游离脂肪酸（FAA）释放量的测定
按照肠消化阶段加入相应试剂后，手动添加0.1 mol/L 氢氧化钠溶液保持体系的pH在7.0。37 ℃磁力搅拌2 h，在0、20、40、60、80、100、120 min时记录添加的氢氧化钠溶液体积。代入公式进行计算。
式中：CNaOH为NaOH浓度，0.1 mol/L；VNaOH为滴加的NaOH溶液的体积；M0为油的摩尔质量，如大豆油880 g/moL；m0为模拟消化过程中所用油的质量，g。
1.2.7 负载AST的CNP-P2乳液的胃肠道行为研究
1.2.7.1 AST标准曲线的绘制
精密称取适量AST标准品，用甲醇和二氯甲烷（1:2）混合溶剂（萃取剂）溶解，配制成浓度为0.2~2.0 μg/mL的系列标准溶液，用紫外分光光度计测定480 nm处的吸光度，以甲醇和二氯甲烷混合溶剂空白调零，测定吸光度。以AST标准溶液的浓度为横坐标，对应吸光度值为纵坐标进行线性回归、绘制标准工作曲线，得到回归方程式：y=0.259x−0.0252（R2=0.99715）。
1.2.7.2 载AST的CNP-P2乳液的制备
取过量AST于大豆油中，在50 ℃的集热式恒温磁力搅拌器中避光搅拌3 h后以3000 r/min的转速离心20 min，取上清液作为油相参照1.2.2制备乳液。
在样品制备后，参照1.2.6进行体外消化试验，通过液滴大小、Zeta电位、微观结构、FFA释放量和生物可及性来评价其胃肠道行为。
1.2.7.3 AST保留率的测定
取新鲜制备的乳液，与萃取剂等体积混合，涡旋振荡10 min，于3000 r/min离20 min后取下清液，反复萃取3次，将下清液合并后在相应吸光值下测定其吸光度，代入标曲计算其含量，并与初始乳液含量对比计算其保留率。分别在紫外光照射2、4、6、8、10、12 h后测量AST含量。
1.2.7.4 生物可及性的测定
取10 mL经胃肠消化模拟后的样品，通过低温离心机在4 ℃，10000 r/min的条件下避光离心30 min，弃掉下层清液，收集中间的胶束层，参照1.2.7.1中的方法萃取胶束层中的AST并测定其含量，同时测定体系中的AST含量。AST生物可及性的计算按下述公式：
式中：Cmicelle为胶束层中AST的含量，μg/mL；Cdigestion为体系中AST的含量，μg/mL。
1.3 数据处理
实验数据的表示形式为平均值±标准差。通过SPSS 26.0软件（IBM，Armonk，NY，USA）中的单因素方差分析比较两组数据。GraphPad Prism软件（San Diego，CA，USA）用来统计作图。P<0.05代表差异显著，P<0.01代表差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 CNP-P2乳液的胃肠道行为分析
2.1.1 乳液界面抵抗胆盐替换/吸附能力
油脂的消化主要发生在小肠阶段。随着脂解反应的进行，脂质会产生大量FFA和单酰基甘油（MAG）并在油的表面不断积累。长链FFA和MAG具有较高的表面活性，可以取代胰脂肪酶，中断脂解反应[27-28]。而小肠中的胆盐因其显著的高表面活性，可能会从油界面置换原本的乳化剂分子，从而增加乳液中脂滴核心对胰脂肪酶活性位点的可及性[29-30]。
Zeta电位是评估多糖和胆盐表面成分变化或表面相互作用的有效方法。相关研究表明，胃肠消化阶段，胆汁提取物中的一些阴离子成分会吸附在液滴表面导致Zeta电位绝对值升高[31]。
由图1可知，随着胆盐浓度的升高，2% CNP-P2乳液的Zeta电位绝对值也随之升高，而后基本保持不变，这可能是胆盐与CNP-P2分子发生了部分置换，但在较长时间内更稳定地下降，这表明胆盐迅速吸附，但随后界面结构的重排相对较慢[32-33]。2% GA乳液在不同胆盐浓度下的Zeta电位值无明显变化，这说明胆盐与GA分子的置换不显著。脂质以乳液的形式摄入或在通过胃的过程中乳化，在脂滴和水性消化介质之间的界面处发生分解[34]。脂质被水解（脂解）会释放两种游离FAA和一种2-单酰甘油。胆盐通过稳定油滴（胆盐吸附在油水界面，并在脂肪酶-脂肪酶复合物的作用下为酶分解界面做好准备）和形成胶束（脂解产物到肠细胞的运输载体）在脂质消化中发挥关键作用[35]。与经典的表面活性剂相比，胆盐没有明确的尾部和头部基团，而是表现为平面极性，这赋予了对疏水相（油、脂肪和脂类）强亲和力的表面活性[29]。因此，胆盐可以迅速吸附在油水界面，改善脂质乳化，增加表面积，并与先前吸附在油滴中的乳化剂竞争[30]。研究结果显示，胆盐能够吸附在乳液液滴表面，取代界面上的CNP-P2，导致部分CNP-P2不再覆盖在液滴表面，而是分布在水相中[30]。
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2.1.2 乳液经胃肠消化的粒径大小和粒径分布分析
液滴的大小和界面性质是决定胃肠道消化中脂滴的消化率以及被封装的生物活性化合物的释放的关键因素。如图2所示，模拟胃消化阶段CNP-P2乳液粒径与初始乳液相比无显著变化（P>0.05），粒径分布也与初始乳液重合，仍呈良好的单峰分布。这说明CNP-P2乳液在模拟胃消化阶段具有良好的稳定性。GA乳液的粒径显著增加（P<0.05），粒径分布在5~15 μm范围内出现一个小的斜率峰。GA乳液呈现不稳定的趋势。
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模拟肠消化阶段，CNP-P2乳液的粒径显著增加（P<0.05），粒径分布范围明显变宽，分布尺寸也明显变大，出现三峰分布现象。这可能是脂质消化后，乳液液滴以三种不同形式存在，体外消化后小肠液含有许多不同的胶体颗粒，例如未消化的脂滴、胶束和未溶解的钙盐[36]。GA乳液的粒径分布范围明显变宽，出现多峰分布现象。说明GA乳液中的脂质成分在肠阶段消化水解[36]。
2.1.3 乳液经胃肠消化的电位分析
图3结果显示，模拟胃消化阶段，CNP-P2乳液的Zeta电位绝对值显著降低（P<0.05），这说明CNP-P2乳液体系在此阶段的静电作用降低了[8]。GA乳液的Zeta电位无显著变化（P>0.05），这说明GA乳液的失稳与静电斥力无关[8]。
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图 3 胃肠消化过程中乳液的电位变化注：A：CNP-P2；B：GA。Figure 3. Changes of emulsion potential during gastrointestinal digestion模拟肠消化阶段，CNP-P2乳液的Zeta电位绝对值显著增高（P<0.05），这说明可能是小肠中磷脂和胆盐形成了带负电的聚集团或者是阴性的FAA的产生引起的[37]。然而图3B的结果显示，GA乳液的Zeta电位绝对值显著降低（P<0.05），这可能是小肠消化阶段中性pH引起的[38]。
2.1.4 乳液经胃肠消化的微观结构分析
图4结果显示，模拟胃消化阶段，CNP-P2乳液的液滴大小均一，液滴分布分散均匀，无明显聚集现象，与初始乳液无明显区别，与粒径、粒径分布的结果一致。这说明CNP-P2乳液界面张力不受胃蛋白酶的影响，乳液仍能维持原有形态。GA乳液出现了大尺寸颗粒，颗粒分布松散，这说明GA乳液而在此期间会发生絮凝。
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图 4 胃肠消化过程中乳液的微观结构变化注：A：2% CNP-P2；B：2% GA。Figure 4. Microstructural changes of emulsion during gastrointestinal digestion模拟肠消化后，乳液中存在的脂滴总量减少，表明部分脂质相已被脂肪酶消化并转化为微小到无法用显微镜观察的实体（例如：混合胶束），大液滴的存在可能是乳液在肠消化的过程发生了合并，这可能会降低脂肪酸释放量和生物可及性。CNP-P2乳液也出现部分聚集也可能是进入小肠后，胆盐与CNP-P2竞争吸附导致被覆盖层变薄，同时吸附带来了更大的静电斥力，破坏了液滴的稳定，从粒径大小分布也可以看到出现了明显大尺寸分布（图2）。GA乳液的液滴出现大面积絮凝，液滴数量仍较多，有大液滴存在。这说明模拟的小肠环境促使GA乳液发生絮凝，大量液滴未能消化。
2.1.5 FAA释放量
FFA的释放程度可以指示脂质包封程度和乳液输送脂溶性物质的能力。通过测定模拟小肠消化阶段的FAA释放量可以分析乳液中油脂的消化分解程度，从而进一步评估乳液的体外模拟消化行为。
由图5结果可知，CNP-P2乳液和GA乳液的FFA释放量在消化前20 min均迅速增加，随后速度变缓，CNP-P2乳液的最终释放量为32.41%，GA乳液的最终释放量为31.68%，两者最终的FFA释放量相似。
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图 5 模拟胃肠消化过程中乳液的FAA释放率随时间变化趋势Figure 5. Trend chart of FAA release rate of emulsion over time during simulated gastrointestinal digestion在肠道消化过程中，乳液液滴的脂肪分解仅在胆盐从油水界面置换乳化剂后发生。脂质消化过程中的FAA释放分为两个阶段，第一个阶段是释放量的快速增加，表明胰脂肪酶在十二指肠条件下立即发生界面吸附；第二个阶段是在较长的时间里FAA释放量随着时间的推移而显着减少，达到平台期[39]。正如先前研究所述，脂肪分解产物是表面活性分子，会倾向于保留在油/水界面上，降低脂肪酶活性，从而降低脂肪酸的释放程度[40]。GA的FAA释放量低可能的原因是乳液形成的液滴粒径较大且在胃阶段的胃脂肪酶作用下进一步絮凝，导致可用于脂解反应的界面面积减少[41]。而CNP-P2乳液的FAA的释放量较低可能是CNP-P2与胆盐分子相互作用，从而阻碍了其对油水界面的吸附，使其无法在界面上吸附脂肪酶分解脂肪[42]。乳化剂和胆盐之间的相互作用可能会影响脂肪分解，因此有必要对它们对脂肪分解的影响进行详细研究。深入了解调节脂肪分解的机制，将有助于更好地设计减少脂肪酸摄入的食品乳液。
2.2 负载AST的CNP-P2乳液胃肠道行为分析
2.2.1 AST保留率的变化分析
紫外灯照射可以加速乳液老化，是缩短实验时间快速评估乳液稳定性的重要手段之一。图6的结果显示，随着紫外光照射时间的延长，AST的保留率逐渐降低，从8 h开始趋于稳定，为74.5%。这说明CNP-P2乳液能较好地保留紫外光照射下AST的含量，有良好的稳定性。
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图 6 不同紫外光照射时间下AST保留率的变化Figure 6. Changes of astaxanthin retention under different UV irradiation time2.2.2 负载AST的CNP-P2乳液经胃肠消化的粒径大小和粒径分布分析
如图7显示，初始阶段，显示负载AST的CNP-P2乳液的MPD（d3,2）为0.59 μm，与CNP-P2乳液的MPD（d3,2）0.62 μm没有显著性差异（P>0.05）。而粒径分布范围明显变宽，并且在10 μm处有一个小杂峰。这可能是由于AST的粒径分布范围较大而引起的[43]。模拟胃消化阶段，负载AST的CNP-P2乳液的粒径无显著变化（P>0.05），粒径分布也与初始乳液重合。这说明负载AST的CNP-P2乳液在模拟胃消化阶段具有良好的稳定性。模拟肠消化阶段，负载AST的CNP-P2乳液的粒径显著增加（P<0.05），粒径分布范围明显变宽，出现三峰分布现象，大波峰往右偏移，与CNP-P2乳液肠消化阶段粒径分布趋势相似。
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图 7 胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的平均粒径（A）和粒径分布大小（B）变化Figure 7. Changes in mean particle size (A) and particle size distribution (B) of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during gastrointestinal digestion2.2.3 负载AST的CNP-P2乳液经胃肠消化的电位分析
图8结果显示，初始阶段，负载AST的CNP-P2乳液的Zeta电位值为−15.2 mV，与CNP-P2乳液Zeta电位值的−29.2 mV相比，绝对值显著降低（P<0.05）。模拟胃消化阶段，负载AST的CNP-P2乳液的Zeta电位绝对值显著降低（P<0.05）。模拟肠消化阶段，CNP-P2乳液的Zeta电位绝对值显著升高（P<0.05），这与CNP-P2乳液的在此阶段的变化趋势相似。
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图 8 胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的电位变化Figure 8. Changes of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion potential during gastrointestinal digestion2.2.4 负载AST乳液经胃肠消化的微观结构分析
图9结果显示，初始阶段，AST被有效地包封在CNP-P2乳液中，液滴大小较为均一，液滴分布分散均匀，无明显聚集现象，这进一步佐证了负载AST的CNP-P2乳液粒径分布范围宽泛，并且有小杂峰出现是AST引起的。模拟胃消化阶段，负载AST的CNP-P2乳液的液滴大小分布与初始乳液无明显区别，与粒径、粒径分布的结果一致。模拟肠消化阶段，观察仍有部分形态完好的液滴以及明显聚集的大液滴存在，这与负载AST的CNP乳液的粒径大小分布结果一致，这佐证了前面对于粒径分布范围对应不同液滴存在的猜测。
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图 9 模拟胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的微观结构变化Figure 9. The microstructural changes of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during simulated gastrointestinal digestion2.2.5 负载AST的CNP-P2乳液的FAA释放量分析
由图10可知，负载AST的CNP-P2乳液的FAA释放量在消化前20 min均迅速增加，随后缓速增加达到27.22%。
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图 10 模拟胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的FAA释放率随时间变化趋势图Figure 10. FAA release rate of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during simulated gastrointestinal digestion over time2.2.6 负载AST的CNP-P2乳液的生物可及性分析
FAA的释放量与小肠中混合胶束的形成量有关，FAA越高，生成的混合胶束越多，从而使更多的AST溶解在混合胶束中[44]。图11的结果显示负载AST的CNP-P2乳液经模拟胃肠消化后生物可及性为44.43%±1.63%，而游离在大豆油中的AST的生物可及性仅为2.5%±0.6%。这说明CNP-P2乳液能够显著提高AST的生物可及性（P<0.05）。
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图 11 负载AST的CNP乳液在模拟胃肠后AST的生物可及性Figure 11. Bioaccessibility of astaxanthin in CNP-P2 emulsion loaded with astaxanthin after gastrointestinal simulation乳液液滴大小和脂肪消化率会影响封装的疏水活性成分的生物利用度[33,45]。这是因为生物活性成分可能被困在未消化的脂质部分中无法释放出来；其次是由脂质消化产生的FFA和MAG可以形成混合胶束，溶解并运输活性成分到肠细胞进一步吸收；最后FFA和MAG在肠细胞内重组形成乳糜微粒，将活性成分运输到淋巴系统后进入体循环[46-47]。因此，如果产生的消化产物的量减少，肠道积液对生物活性成分的溶解能力就会降低。结合实验结果，负载AST的CNP-P2乳液初始液滴分布范围较广，且脂质消化释放FAA的量较低，这就导致了AST在CNP-P2乳液中生物可及性低，从而影响到其生物利用度。
3. 结论
CNP-P2兼具优良的乳化活性及稳定性、界面活性和延缓脂质消化能力，可作为乳化剂稳定消化乳液。CNP-P2具有一定稳定AST的能力，能够显著提高大豆油（2.5%）中AST的生物可及性。在有效延缓脂质消化的前提下，利用CNP-P2制备的慢消化乳液能有效递送AST。这些结果表明，CNP-P2可作为一种理想的新型乳化剂应用于多种相关行业，并有助于进一步深入研究C. nutans的功能特性，为相关功能性产品的开发提供了新思路。然而，不同提取方式或不同组分的CNP结构差异与其乳化性能的关系尚未阐明，CNP乳液负载AST后在体内的靶向活性作用尚未探究。后续研究将集中在C. nutans多糖的构效关系以及C. nutans多糖负载活性成分的细胞和动物模型等方面，推动C. nutans多糖进一步的开发与利用。
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图 3 胃肠消化过程中乳液的电位变化
注：A：CNP-P2；B：GA。
Figure 3. Changes of emulsion potential during gastrointestinal digestion
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图 4 胃肠消化过程中乳液的微观结构变化
注：A：2% CNP-P2；B：2% GA。
Figure 4. Microstructural changes of emulsion during gastrointestinal digestion
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图 5 模拟胃肠消化过程中乳液的FAA释放率随时间变化趋势
Figure 5. Trend chart of FAA release rate of emulsion over time during simulated gastrointestinal digestion
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图 6 不同紫外光照射时间下AST保留率的变化
Figure 6. Changes of astaxanthin retention under different UV irradiation time
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图 7 胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的平均粒径（A）和粒径分布大小（B）变化
Figure 7. Changes in mean particle size (A) and particle size distribution (B) of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during gastrointestinal digestion
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图 8 胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的电位变化
Figure 8. Changes of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion potential during gastrointestinal digestion
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图 9 模拟胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的微观结构变化
Figure 9. The microstructural changes of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during simulated gastrointestinal digestion
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图 10 模拟胃肠消化过程中负载AST的CNP-P2乳液的FAA释放率随时间变化趋势图
Figure 10. FAA release rate of astaxanthin loaded CNP-P2 emulsion during simulated gastrointestinal digestion over time
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