Optimization of the Fermentation Conditions of Poly-γ-Glutamic Acid from Natto by PB Experiment Combined with BBD Response Surface Method
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摘要: 为探究发酵纳豆γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）产量和感官品质的最佳发酵条件，本实验以纳豆发酵后的γ-PGA产量和感官评价的综合评分为指标，利用单因素实验、Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面法优化纳豆发酵工艺。确定纳豆的最佳发酵条件为：大豆浸泡pH7.2，发酵温度37.10 ℃，发酵时间24.20 h，接种量4.00%，装瓶量19.90%，在此优化条件下，γ-PGA产量达3.65 mg/g，感官评分为31.67，综合评分为10.04，实验结果与模型预测值无显著性差异，稳定可靠。
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关键词:
- 纳豆 /
- γ-聚谷氨酸 /
- 感官评价 /
- Plackett-Burman试验设计 /
- Box-Behnken响应面法
Abstract: In order to explore the optimal fermentation conditions for the poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) production and sensory quality of fermented natto, the comprehensive score of γ-PGA production and sensory evaluation after natto fermentation was used as an index to optimize the natto fermentation process by single factor test, Plackett-Burman test design, steepest climbing test and Box-Behnken response surface method. The optimum fermentation conditions of natto were determined as follows: Soybean soaking pH7.2, fermentation temperature 37.10 ℃, fermentation time 24.20 h, inoculation amount 4.00%, bottling amount 19.90%. Under the optimized conditions, the production of γ-PGA was 3.65 mg/g, the sensory score was 31.67, and the comprehensive score was 10.04. There was no significant difference between the experimental results and the model prediction values, which was stable and reliable. -
纳豆由大豆蒸煮后接种纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）发酵而成，起源于日本，日本人食用纳豆的历史已长达两千多年[1−3]。纳豆含有丰富的功能物质，如纳豆激酶、维生素K2等，具有预防心血管疾病、预防骨质疏松、降血糖、降低血压和抗氧化等保健功能[4−9]。目前，对纳豆的功能物质研究主要集中在纳豆激酶和维生素K2，对其他功能物质报道较少。γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是纳豆发酵过程产生的一种重要的活性物质，具有抗肥胖、促进钙吸收等功能[10−12]。γ-PGA也是纳豆黏液的主要成分[13−14]。优质的纳豆黏液呈白色，味道清淡或微酸，质地柔软粘稠，拉丝长，这也是评判优质纳豆的重要标准[15−17]。
γ-PGA是由D/L谷氨酸单体或两个对映体通过α-氨基和γ-羧酸基之间的酰胺键连接在一起的阴离子多肽，其聚合度在1000~15000之间，分子量越高，黏度越高[18−19]。γ-PGA具有良好的水溶性，并且能完全被生物降解，对人体和环境无毒害无污染，在食品、农业、化妆品和医药等方面具有广泛的应用[20−24]。合成γ-PGA的方法主要有化学合成、肽合成、生物转化和微生物发酵[25]。微生物发酵法生产γ-PGA具有效率高、环境污染小、反应条件温和等优点[26]。
目前，微生物发酵产γ-PGA多数采用液态发酵，缺乏对纳豆食品发酵产γ-PGA条件优化的相关研究。本实验采用纳豆芽孢杆菌发酵纳豆，利用Plackett-Burman试验设计结合Box-Behnken响应面法，以γ-PGA产生量和纳豆感官品质的加权综合评分为指标，对纳豆发酵条件进行优化。确定了纳豆γ-PGA的最佳发酵条件，推动了高产γ-PGA纳豆的市场发展。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto） 本实验室保藏；巴西10号、巴西13号、华夏3号、粤小黄1号、粤小黄2号、粤小黄3号6种品种大豆 华南农业大学农学院大豆分子设计育种实验室提供；氯化钠 天津市大茂化学试剂厂；牛肉膏 广州环凯微生物科技有限公司；蛋白胨、琼脂粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；γ-聚谷氨酸标准品 南京赛泰斯生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠 天津福晨化学试剂有限公司；盐酸 广州化学试剂厂；无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司。
HZS-H水浴振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；HYL-C3组合式摇床 山东博科科学仪器有限公司；SW-CJ-2F洁净工作台 苏静集团苏州安泰空气技术有限公司；YX-24HDD手提式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；HC-3018高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1750紫外可见分光光度计 日本岛津公司；BCD-215YD冰箱 青岛海尔股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的配制
斜面培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.9%，琼脂1.5%，pH7.2；种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.9%，pH7.2。上述所有培养基于121 ℃下灭菌30 min后冷却待用。
1.2.2 纳豆芽孢杆菌的活化和培养
将纳豆芽孢杆菌接种于LB斜面固体培养基上，37 ℃活化24 h，活化2次。将平板上的纳豆芽孢杆菌接种到液体培养基中，在37 ℃恒温水浴中180 r/min摇瓶培养24 h，随后5000 r/min离心10 min，再加入无菌水，形成1×107 CFU/mL的菌悬液，作为种子液保存。
1.2.3 纳豆发酵产γ-PGA的工艺流程
1.2.3.1 纳豆发酵
对大豆进行挑选、清洗，随后用干净自来水常温浸泡18 h。将浸泡好的大豆沥干，于常压、121 ℃下蒸煮30 min，自然冷却至37 ℃左右进行接种（接种后需要搅拌均匀大豆和种子液），发酵。发酵完成后放于4 ℃冰箱下进行后熟24 h[27−28]。
1.2.3.2 γ-PGA的初步纯化
称取1 g纳豆于离心管中，加入10 mL蒸馏水，8000 r/min离心15 min，除去菌体，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，在4 ℃下静置过夜后，8000 r/min离心15 min，取沉淀，加入与上清液体积相等的蒸馏水溶解，随后稀释20倍后进行测定。
1.2.4 单因素实验
通过不同品种大豆发酵纳豆，根据发酵结果取最优大豆进行后续发酵工艺实验。在大豆浸泡pH7.0、接种量4%、装瓶量15%、发酵温度37 ℃和发酵时间24 h的固定条件下，分别考察大豆浸泡pH（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）、接种量（1%、2%、4%、6%、8%）、装瓶量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵温度（33、35、37、39、41 ℃）和发酵时间（18、21、24、27、30 h）对纳豆发酵工艺的影响。每个因素进行3次平行实验，记录平均值。
1.2.5 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burma（PB）是一种2水平的试验方法，可以用较少的实验从众多影响因素中快速筛选出显著影响因素[29]。根据前期单因素预实验结果，对大豆浸泡pH、接种量、装瓶量、发酵温度、发酵时间5个因素进行考察。每个因素选取高（1）和低（−1）两个水平，设置3个虚拟列。设计N=12的PB试验（表1）。
表 1 Plackett-Burman试验设计因素水平Table 1. Plackett-Burman experimental design factor level因素 水平 −1 1 A 大豆浸泡pH 7 7.4 B 接种量（%） 3 6 C 装瓶量（%） 15 25 D 发酵温度（℃） 35 39 E 发酵时间（h） 21 27 1.2.6 最陡爬坡试验
响应面拟合方程只有在接近最优值（综合得分最高）的区域才能完全模拟真实情况。因此，需要通过最陡爬坡试验逼近最优值区域，进行有效的响应面分析。根据PB试验结果，得到对综合得分影响最明显的3个因素，并根据其正负效应设计步长和变化方向。估计值为正则为正效应，反之则为负效应，快速达到最优响应区域[30]。
1.2.7 Box-Behnken响应面试验
根据PB试验和最陡爬坡试验分析结果确定的3个因素，以综合评分为响应值，对每个因素的3个水平进行（−1、0、+1）编码。每个试验点平行3次。呈现正效应的因素采用高水平，呈现负效应的因素采用低水平。Box-Behnken试验设计（BBD）的因素及水平见表2。
表 2 Box-Behnken试验因素与水平Table 2. Factors and levels of Box-Behnken test因素 水平 −1 0 1 A装瓶量（%） 18 20 22 B发酵温度（℃） 36 37 38 C发酵时间（h） 23 24 25 1.2.8 γ-PGA测定
本文参考Yan等[31]的方法进行发酵纳豆γ-PGA测定。
1.2.8.1 γ-PGA标准溶液的配制
精确称取一定量的γ-聚谷氨酸标准品，用蒸馏水溶解，稀释至含量为100 μg/mL的γ-PGA标准液。精密量取10、20、30、40、50 mL上述溶液，分别置于1～5号容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀，得到10～50 μg/mL的γ-PGA标准液，待检测。
1.2.8.2 CTAB溶液的配制
配制2% NaOH溶液，并以此为溶剂，加入CTAB，搅拌溶解，配制成5 g/L的CTAB试液。
1.2.8.3 CTAB 比浊法
取2 mL待测液于试管中，准确加入2 mL CTAB试液，轻微振荡，静置3 min，将反应液倒入比色皿中，以蒸馏水和CTAB试液混合作为空白，测定在波长224 nm下的吸光值。以γ-PGA标准品浓度为横坐标，224 nm处的吸光值为纵坐标，得到γ-PGA标准曲线的线性方程为Y=0.0216X+0.0734，R2=0.9913。将所测得的样品吸光值代入标准曲线，并根据下式（1）计算γ-PGA含量：
γ-PGA(mg/g)=稀释液浓度(μg/mL)×稀释倍数×103纳豆质量浓度(g/mL) (1) 1.2.9 感官评价方法
由经过专业培训的人员组成评价小组（5男5女）对纳豆的色泽、气味、滋味和拉丝进行评分，分值范围为0~10分[32]。纳豆感官评分标准见表3。
表 3 纳豆感官评价表Table 3. Natto sensory evaluation table分数 色泽（0~10分） 气味（0~10分） 滋味（0~10分） 拉丝（0~10分） 10 豆粒呈金黄色，表皮富有光泽 氨味较轻，有纳豆独特的香气 软糯，湿滑，无后苦味 黏性强，拉丝长 8 豆粒呈暗黄色，表皮有光泽 有少许氨味，有纳豆香气 较软糯，较湿润，无后苦味 黏性较强，拉丝较强 6 豆粒呈暗黄色，表皮无光泽 氨味稍重，有较淡的纳豆香气 较软糯，较湿润，后苦味较轻 黏性一般，拉丝一般 4 豆粒呈茶褐色，表皮无光泽 氨味较重，几乎没有纳豆香气 较软糯，较干燥，苦味较重 黏性较差，拉丝较短 2 豆粒呈暗褐色，表皮无光泽 强烈氨臭味，无纳豆香气 较硬，干燥，苦味重 几乎无黏性，拉丝短 1.2.10 综合评分的计算方法
以γ-PGA产量和感官评价的综合评分为指标进行分析[33]，如下式（2）：
综合评分=0.5×(γ-PGA产量(mg/g)不同纳豆γ-PGA产量最大值(mg/g)+感官总分不同纳豆感官总分最大值)×10 (2) 1.3 数据处理
每个样品重复测定3次，利用Desgin-Expert 8.06软件对试验结果进行分析，优化各因素最优条件并根据预测结果进行验证。采用SPSS 16.0对数据进行显著性和误差分析，采用Origin 2018作图。
2. 结果与分析
2.1 单因素优化发酵条件
2.1.1 不同大豆品种筛选
在一定发酵条件下，测定巴西10号、巴西13号、华夏3号、粤小黄1号、粤小黄2号、粤小黄3号6种品种纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分。由图1可知，6种品种大豆发酵纳豆产γ-PGA及其感官品质有一定的差异。整体上看，华夏大豆和粤小黄大豆发酵纳豆γ-PGA产生量及其感官品质高于巴西大豆发酵纳豆，且γ-PGA产生量和纳豆感官品质呈一定的正比关系。粤小黄2号纳豆γ-PGA产生量和综合评分最高，分别达到3.28 mg/g和9.45，华夏3号感官总分最高为31.83。巴西10号纳豆γ-PGA产生量和综合评分最低，分别为2.30 mg/g和8.07，粤小黄3号感官总分最低为30.00。根据以上结果，选用γ-PGA产生量和综合评分最高的粤小黄2号进行后续的发酵实验。
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图 1 不同大豆品种发酵纳豆产γ-PGA的差异Figure 1. The difference of γ-PGA produced by fermented natto from different soybean varieties2.1.2 不同大豆浸泡pH对纳豆发酵产γ-PGA的影响
测定大豆浸泡pH6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的粤小黄2号纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分，大豆浸泡pH对纳豆品质的影响如图2所示。由图2可知，随着浸泡pH的增大，γ-PGA产生量及综合评分呈现出先上升后下降的趋势，当浸泡pH达到7.2时，γ-PGA产生量及综合评分达到最大值，之后开始降低。可能是因为pH过高或者过低，不利于菌株生长繁殖，最终形成芽孢，停止产γ-PGA[34]。但是纳豆的感官总分几乎保持不变，说明此pH区间对纳豆感官品质的影响不大。因此，纳豆发酵产γ-PGA的大豆最佳pH为7.2。
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图 2 不同大豆浸泡pH对纳豆发酵产γ-PGA的影响Figure 2. Effects of different soybean soaking pH values on the production of γ-PGA by natto fermentation2.1.3 不同接种量对纳豆发酵产γ-PGA的影响
测定接种量为1%、2%、4%、6%、8%的粤小黄2号纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分。接种量对纳豆品质的影响如图3所示，由图3可得，随着接种量的增大，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分呈现出先急速上升后缓慢下降的趋势。当接种量小于4%时，三个评价指标均处于低水平。这是因为当接种量较低时，纳豆芽孢杆菌不能将纳豆充分发酵，但当接种量达4%时，纳豆芽孢杆菌能最大程度地利用大豆中的营养物质，使γ-PGA产生量、感官总分和综合评分达到最佳。当接种量大于4%时，三个评价指标缓慢下降。可能是菌量过多，形成竞争。也可能是由于营养物质的减少与其代谢产物的增加抑制了发酵过程，导致纳豆γ-PGA产生量变少，感官总分和综合评分降低[3]。因此，纳豆发酵产γ-PGA的最佳接种量为4%。
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图 3 不同接种量对纳豆发酵产γ-PGA的影响Figure 3. Effects of different inoculations on production of γ-PGA by natto fermentation2.1.4 不同装瓶量对纳豆发酵产γ-PGA的影响
测定装瓶量为5%、10%、15%、20%、25%的粤小黄2号纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分，装瓶量对纳豆品质的影响如图4所示。由图4可得，随着装瓶量的增大，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分呈现出先急速上升后下降的趋势。当装瓶量为20%时，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分最高，这与周雪琴等[34]、Yang等[35]的研究结果一致。这可能是因为装瓶量过少时，营养物质缺乏，不足以支撑菌株的生长繁殖，最终形成芽孢，停止产γ-PGA；当装瓶量过多时，会导致营养物质不能被最大利用，发酵不完全，感官品质不够好。因此，纳豆发酵产γ-PGA的最佳装瓶量为20%。
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图 4 不同装瓶量对纳豆发酵产γ-PGA的影响Figure 4. Effects of different bottling quantities on production of γ-PGA by natto fermentation2.1.5 不同发酵温度对纳豆发酵产γ-PGA的影响
温度是影响微生物生长与代谢的重要原因。测定发酵温度为33、35、37、39、41 ℃的粤小黄2号纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分。发酵温度对纳豆品质的影响如图5所示，由图5可知，随着发酵温度的增大，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分呈现出先急速上升后缓慢下降的趋势。当发酵温度为37 ℃时，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分最高，这与Feng等[36]的研究结果相近。温度过高或过低不仅对菌株的正常生长有影响，而且发生反应所需要的酶在高温下失活，在低温下活性受到较大的抑制，从而导致γ-PGA的产量降低，发酵不完全，感官品质变差[26]。因此，纳豆发酵产γ-PGA的最佳发酵温度为37 ℃。
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图 5 不同发酵温度对纳豆发酵产γ-PGA的影响Figure 5. Effects of different fermentation temperatures on γ-PGA production by natto fermentation2.1.6 不同发酵时间对纳豆发酵产γ-PGA的影响
测定发酵时间为18、21、24、27、30 h的粤小黄2号纳豆的感官总分及γ-PGA含量，计算综合评分。发酵时间对纳豆品质的影响如图6所示，由图6可知，随着发酵时间的延长，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分迅速增长，当发酵时间达24 h时，三个评价指标达到最大，这与陈乐乐等[3]、Yang等[35]的研究结果一致。之后γ-PGA产生量、感官总分和综合评分随时间的增加趋于平稳或缓慢降低。发酵时间的长短对菌株的繁殖及成品纳豆的性质都会有一定影响。发酵初期，纳豆菌代谢加快产物积累，γ-PGA产生量、感官总分升高；随着发酵时间到一定的范围，纳豆菌代谢下降，逐渐不转化剩余的营养物质，故γ-PGA产生量、感官总分趋于平稳或者缓慢降低[37]。因此，纳豆发酵产γ-PGA的最佳发酵时间为24 h。
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图 6 不同发酵时间对纳豆发酵产γ-PGA的影响Figure 6. Effects of different fermentation time on the production of γ-PGA by natto fermentation2.2 Plackett-Burman试验
纳豆发酵产γ-PGA综合评分的Plackett-Burman试验结果及方差分析见表4、表5。利用 Design Expert 8.0.6 软件，以综合评分Y为响应值，得到回归方程为Y=7.81−0.018A−0.017B−0.050C+0.66D+0.33E，R2=0.9987。表明该回归方程模型的拟合度良好，回归方程具有代表性。其中R2adj=0.9976，表明模型适用于99.76%的效应值。表5方差分析结果显示，发酵温度（D）、发酵时间（E）、装瓶量（C）的结果对综合分数（Y）有较显著影响（P<0.01），各因素影响的大小为D>E>C，其他2个因素影响不显著，故取发酵温度、发酵时间和装瓶量这三个因素进行后续爬坡试验。
表 4 Plackett-Burman试验设计与结果Table 4. Plackett-Burman test design and results试验号 标准序 A B C D E γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 9 1 1 −1 1 1 2.98 29.50 8.78 2 4 −1 1 1 −1 1 2.50 25.17 7.43 3 11 1 −1 1 1 −1 2.78 27.17 8.12 4 7 −1 1 −1 1 1 3.01 29.83 8.86 5 6 −1 −1 1 −1 1 2.54 25.17 8.48 6 8 −1 −1 −1 1 −1 2.82 27.50 8.24 7 5 1 −1 −1 −1 1 2.56 25.50 7.56 8 3 1 1 −1 −1 −1 2.25 23.83 6.87 9 10 1 1 1 −1 −1 2.22 23.17 6.72 10 2 −1 1 1 1 −1 2.77 27.17 8.11 11 1 1 −1 1 1 1 2.97 29.17 8.71 12 12 −1 −1 −1 −1 −1 2.26 23.67 6.86 表 5 Plackett-Burman试验设计方差分析Table 5. Analysis of variance for Plackett-Burman trial design方差来源 离差
平方和自由度 均方 F值 P值 显著性 影响
顺序模型 6.51 5 1.30 900.79 <0.0001 *** A 4.033E-003 1 4.003E-003 2.79 0.1458 4 B 3.333E-003 1 3.333E-003 2.31 0.1795 5 C 0.030 1 0.030 20.77 0.0039 ** 3 D 5.20 1 5.20 3600.58 <0.0001 *** 1 E 1.27 1 1.27 877.50 <0.0001 *** 2 残差 8.667E-003 6 1.444E-003 总离差 6.51 11 R2=0.9987；R2adj=0.9976；R2Pred=0.9947；C.V.%=0.49 注：“*”表示显著水平（P<0.05），“**”表示较显著水平（P<0.01），“***”表示极显著水平（P<0.001）；表8同。 2.3 最陡爬坡试验结果
从表6中可以看出，随着装瓶量、发酵温度、发酵时间这三个重要因素的趋势性变化，纳豆γ-PGA产生量、感官总分和综合评分呈先上升后下降的趋势，并且在第3组实验的条件下，三个指标达到最高。因此，以该试验组为下一步响应面的中心试验点，进行响应面试验。
表 6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6. Test design and results of steepest climb序号 装瓶量
（%）发酵温度
（℃）发酵时间
（h）γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 16 35 22 2.25 23.83 6.87 2 18 36 23 3.21 30.33 9.23 3 20 37 24 3.63 32.00 10.07 4 22 38 25 3.19 30.67 9.26 5 24 39 26 3.10 30.33 9.06 2.4 响应面分析结果
纳豆发酵产γ-PGA综合评分的响应面分析试验结果见表7，回归模型的方差分析见表8。利用Design Expert 8.0.6 软件对表7中综合评分数据进行二次多元回归拟合，回归方程如下：Y综合评分=10.04−0.029A+0.065B+0.096C+5.000E−003AB−7.500E−003AC+0.010BC−0.27A2−0.60B2−0.25C2。
表 7 Box-Behnken试验设计及结果Table 7. Box-Behnken test design and results试验号 标准序 A B C γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 13 −1 −1 0 3.26 28.83 9.13 2 14 1 −1 0 3.29 29.00 9.06 3 17 −1 1 0 3.25 30.00 9.28 4 10 1 1 0 3.25 30.33 9.23 5 7 −1 0 −1 3.31 31.00 9.51 6 8 1 0 −1 3.34 31.00 9.47 7 11 −1 0 1 3.34 31.17 9.60 8 6 1 0 1 3.37 31.33 9.53 9 12 0 −1 −1 3.26 28.50 9.00 10 3 0 1 −1 3.24 29.17 9.08 11 4 0 −1 1 3.28 31.17 9.29 12 15 0 1 1 3.25 31.17 9.41 13 9 0 0 0 3.61 31.67 9.99 14 5 0 0 0 3.63 32.00 10.07 15 2 0 0 0 3.68 31.67 10.08 16 16 0 0 0 3.65 31.83 10.07 17 1 0 0 0 3.65 31.33 9.99 表 8 Box-Behnken试验回归模型及方差分析Table 8. Box-Behnken test regression model and variance analysis方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 影响
顺序模型项 2.36 9 0.26 47.09 <0.0001 *** A 6.612E-003 1 6.612E-003 1.19 0.3115 6 B 0.034 1 0.034 6.08 0.0431 * 5 C 0.074 1 0.074 13.33 0.0082 ** 4 AB 1.000E-004 1 1.000E-004 0.018 0.8972 9 AC 2.250E-004 1 2.250E-004 0.040 0.8463 8 BC 4.000E-004 1 4.000E-004 0.072 0.7962 7 A2 0.30 1 0.30 53.30 0.0002 *** 2 B2 1.50 1 1.50 270.69 <0.0001 *** 1 C2 0.25 1 0.25 45.57 0.0003 *** 3 误差 0.039 7 5.558E-003 失拟项 0.029 3 9.808E-003 4.14 0.1018 不显著 纯误差差 9.480E-003 4 2.370E-003 总离差 2.39 16 R2=0.9838，R2adj=0.9629，R2pred=0.7972，C.V.%=0.78 由表8可知，综合评分模型的F值为47.09，P<0.0001，说明模型均高度显著，模型成立。失拟项为4.14，P>0.05不显著，说明未知因素对实验的影响小。该模型R2为0.9838，R2adj为0.9629，即表明该模型可以解释96.29%的纳豆发酵综合评分的变化，仅有大概3.71%变化不能被预测。模型与实际实验的拟合程度好，可用于分析与预测各因素对纳豆发酵产γ-PGA综合评分的影响。由表8可知，方程中一次项B对纳豆发酵产γ-PGA的综合评分影响显著（P<0.05），而一次项C对纳豆发酵产γ-PGA的综合评分影响较显著（P<0.01），二次项A2、B2、C2的影响极显著（P<0.001），说明各因素对纳豆发酵产γ-PGA综合评分的影响呈二次关系，而非简单的线性关系。由F值检验可知各因素对综合评分影响的大小顺序为：C>B>A，即发酵时间>发酵温度>装瓶量。
2.5 响应面因素间的交互作用分析
为了更直观地观察3因素之间的交互作用，确定综合评分最高点。根据上述回归方程和回归模型方差分析表，利用Design-expert软件绘制响应面分析图及其等高线图（图7）。每个响应面代表在保持一个变量的最优条件下，其他两个自变量之间的交互作用对纳豆发酵产γ-PGA综合评分的影响。
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图 7 两两因素交互作用对综合评分影响的响应面和等高线图Figure 7. Response surface and contour map of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score从图7的响应面分析图可以看出，在一个变量确定的情况下，其他两个因素对综合评分的影响基本呈抛物线状，且存在极大值点，变化趋势为先增大后减小。响应面越陡，等高线的疏密度分布越不均匀，说明交互作用越大。图7的（a）、（c）图中曲面相对较为陡峭，（b）、（d）图中等高线的疏密度分布较不均匀、呈近似马鞍形[38]，说明装瓶量与发酵温度、装瓶量与发酵时间均有一定交互作用，对综合评分有一定的影响，但不显著，与表8中的P值相对应（P>0.05）。图7的（e）图虽然曲面相对较为陡峭，但是其等高线（f）图近似圆形，说明发酵温度与发酵时间的交互作用不显著，这与回归模型中的方差分析结果一致。
2.6 验证实验
回归模型预测的纳豆发酵产γ-PGA最优发酵条件及综合评分为：装瓶量19.89%，发酵温度37.06 ℃，发酵时间24.20 h，综合评分为10.05。根据实际情况，将发酵条件修正为装瓶量19.90%、发酵温度37.10 ℃、发酵时间24.20 h，进行3次平行发酵验证实验。结果得出，γ-PGA产量为3.65 mg/g，感官总评分为31.67分，综合评分为10.04分。实际值与预测值无显著性差异（P>0.05），说明得到的最优发酵条件参数可靠，模型得到的实验结果具有较强的实际意义。
3. 结论
以γ-PGA产生量和纳豆感官总分的综合评分为依据，对纳豆发酵产γ-PGA进行工艺优化。结果表明：在大豆浸泡pH、接种量、装瓶量、发酵温度和发酵时间单因素优化实验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计方法筛选出对综合评分影响最大的3个因素是装瓶量、发酵温度和发酵时间。通过最陡爬坡试验选取接近综合得分最高的3个重要水平，最后通过Box-Behnken响应面试验设计，得到纳豆发酵产γ-PGA的最优实际发酵条件：装瓶量19.90%、发酵温度37.10 ℃、发酵时间24.20 h，此时，综合评分为10.05。最终验证实验的综合评分为10.04，与预测值相差不大。这说明模型得到的预测结果稳定可靠，能够指导实际生产应用。
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图 1 不同大豆品种发酵纳豆产γ-PGA的差异
Figure 1. The difference of γ-PGA produced by fermented natto from different soybean varieties
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图 2 不同大豆浸泡pH对纳豆发酵产γ-PGA的影响
Figure 2. Effects of different soybean soaking pH values on the production of γ-PGA by natto fermentation
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图 3 不同接种量对纳豆发酵产γ-PGA的影响
Figure 3. Effects of different inoculations on production of γ-PGA by natto fermentation
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图 4 不同装瓶量对纳豆发酵产γ-PGA的影响
Figure 4. Effects of different bottling quantities on production of γ-PGA by natto fermentation
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图 5 不同发酵温度对纳豆发酵产γ-PGA的影响
Figure 5. Effects of different fermentation temperatures on γ-PGA production by natto fermentation
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图 6 不同发酵时间对纳豆发酵产γ-PGA的影响
Figure 6. Effects of different fermentation time on the production of γ-PGA by natto fermentation
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图 7 两两因素交互作用对综合评分影响的响应面和等高线图
Figure 7. Response surface and contour map of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score
表 1 Plackett-Burman试验设计因素水平
Table 1 Plackett-Burman experimental design factor level
因素 水平 −1 1 A 大豆浸泡pH 7 7.4 B 接种量（%） 3 6 C 装瓶量（%） 15 25 D 发酵温度（℃） 35 39 E 发酵时间（h） 21 27 
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表 2 Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test
因素 水平 −1 0 1 A装瓶量（%） 18 20 22 B发酵温度（℃） 36 37 38 C发酵时间（h） 23 24 25
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表 3 纳豆感官评价表
Table 3 Natto sensory evaluation table
分数 色泽（0~10分） 气味（0~10分） 滋味（0~10分） 拉丝（0~10分） 10 豆粒呈金黄色，表皮富有光泽 氨味较轻，有纳豆独特的香气 软糯，湿滑，无后苦味 黏性强，拉丝长 8 豆粒呈暗黄色，表皮有光泽 有少许氨味，有纳豆香气 较软糯，较湿润，无后苦味 黏性较强，拉丝较强 6 豆粒呈暗黄色，表皮无光泽 氨味稍重，有较淡的纳豆香气 较软糯，较湿润，后苦味较轻 黏性一般，拉丝一般 4 豆粒呈茶褐色，表皮无光泽 氨味较重，几乎没有纳豆香气 较软糯，较干燥，苦味较重 黏性较差，拉丝较短 2 豆粒呈暗褐色，表皮无光泽 强烈氨臭味，无纳豆香气 较硬，干燥，苦味重 几乎无黏性，拉丝短
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表 4 Plackett-Burman试验设计与结果
Table 4 Plackett-Burman test design and results
试验号 标准序 A B C D E γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 9 1 1 −1 1 1 2.98 29.50 8.78 2 4 −1 1 1 −1 1 2.50 25.17 7.43 3 11 1 −1 1 1 −1 2.78 27.17 8.12 4 7 −1 1 −1 1 1 3.01 29.83 8.86 5 6 −1 −1 1 −1 1 2.54 25.17 8.48 6 8 −1 −1 −1 1 −1 2.82 27.50 8.24 7 5 1 −1 −1 −1 1 2.56 25.50 7.56 8 3 1 1 −1 −1 −1 2.25 23.83 6.87 9 10 1 1 1 −1 −1 2.22 23.17 6.72 10 2 −1 1 1 1 −1 2.77 27.17 8.11 11 1 1 −1 1 1 1 2.97 29.17 8.71 12 12 −1 −1 −1 −1 −1 2.26 23.67 6.86
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表 5 Plackett-Burman试验设计方差分析
Table 5 Analysis of variance for Plackett-Burman trial design
方差来源 离差
平方和自由度 均方 F值 P值 显著性 影响
顺序模型 6.51 5 1.30 900.79 <0.0001 *** A 4.033E-003 1 4.003E-003 2.79 0.1458 4 B 3.333E-003 1 3.333E-003 2.31 0.1795 5 C 0.030 1 0.030 20.77 0.0039 ** 3 D 5.20 1 5.20 3600.58 <0.0001 *** 1 E 1.27 1 1.27 877.50 <0.0001 *** 2 残差 8.667E-003 6 1.444E-003 总离差 6.51 11 R2=0.9987；R2adj=0.9976；R2Pred=0.9947；C.V.%=0.49 注：“*”表示显著水平（P<0.05），“**”表示较显著水平（P<0.01），“***”表示极显著水平（P<0.001）；表8同。
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表 6 最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Test design and results of steepest climb
序号 装瓶量
（%）发酵温度
（℃）发酵时间
（h）γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 16 35 22 2.25 23.83 6.87 2 18 36 23 3.21 30.33 9.23 3 20 37 24 3.63 32.00 10.07 4 22 38 25 3.19 30.67 9.26 5 24 39 26 3.10 30.33 9.06
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表 7 Box-Behnken试验设计及结果
Table 7 Box-Behnken test design and results
试验号 标准序 A B C γ-PGA产量
（mg/g）感官
总分综合
评分1 13 −1 −1 0 3.26 28.83 9.13 2 14 1 −1 0 3.29 29.00 9.06 3 17 −1 1 0 3.25 30.00 9.28 4 10 1 1 0 3.25 30.33 9.23 5 7 −1 0 −1 3.31 31.00 9.51 6 8 1 0 −1 3.34 31.00 9.47 7 11 −1 0 1 3.34 31.17 9.60 8 6 1 0 1 3.37 31.33 9.53 9 12 0 −1 −1 3.26 28.50 9.00 10 3 0 1 −1 3.24 29.17 9.08 11 4 0 −1 1 3.28 31.17 9.29 12 15 0 1 1 3.25 31.17 9.41 13 9 0 0 0 3.61 31.67 9.99 14 5 0 0 0 3.63 32.00 10.07 15 2 0 0 0 3.68 31.67 10.08 16 16 0 0 0 3.65 31.83 10.07 17 1 0 0 0 3.65 31.33 9.99
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表 8 Box-Behnken试验回归模型及方差分析
Table 8 Box-Behnken test regression model and variance analysis
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 影响
顺序模型项 2.36 9 0.26 47.09 <0.0001 *** A 6.612E-003 1 6.612E-003 1.19 0.3115 6 B 0.034 1 0.034 6.08 0.0431 * 5 C 0.074 1 0.074 13.33 0.0082 ** 4 AB 1.000E-004 1 1.000E-004 0.018 0.8972 9 AC 2.250E-004 1 2.250E-004 0.040 0.8463 8 BC 4.000E-004 1 4.000E-004 0.072 0.7962 7 A2 0.30 1 0.30 53.30 0.0002 *** 2 B2 1.50 1 1.50 270.69 <0.0001 *** 1 C2 0.25 1 0.25 45.57 0.0003 *** 3 误差 0.039 7 5.558E-003 失拟项 0.029 3 9.808E-003 4.14 0.1018 不显著 纯误差差 9.480E-003 4 2.370E-003 总离差 2.39 16 R2=0.9838，R2adj=0.9629，R2pred=0.7972，C.V.%=0.78
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