Effects of Different Extraction Processes on the Structure and Functional Properties of Camellia Seeds Protein
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摘要: 油茶籽粕作为茶油生产中的主要副产物，含有大量未被利用的优质植物蛋白质，为了探究超声处理和酶处理在提取过程中对蛋白质的影响，采用碱溶酸沉法（Alkali dissolves acid precipitation，ADAP）、酶解（预处理）法（Enzyme Extraction，EE）、超声碱溶酸沉法（Ultrasonic Alkali Dissolving Acid Precipitation，UADAP）、超声酶解法（Ultrasonic Enzyme Extraction，UEE）从油茶饼粕中提取蛋白质，并对其结构性质和功能特性进行对比分析。结果表明：超声波处理会使酰胺I带的红外波峰从1629 cm−1红移至1649cm−1，蛋白质分子内部的Trp残基被暴露出来，导致蛋白质的荧光强度升高，离子键的含量在分子间作用力中的占比提高至31.17%，酶法处理和碱溶酸沉处理同样会对蛋白质的结构造成影响，但二者无较大差别，且效果较弱；通过ADAP组与UADAP组对比，可以发现超声将油茶籽粕蛋白的乳化性提高了34.43%，凝胶硬度提高了51.36%，凝胶弹性提高了38.13%；ADAP组与EE组对比，发现酶解处理则能较好的增强蛋白质的乳化稳定性及起泡性，分别提高了93.35%和44.28%，而碱溶酸沉处理可使蛋白质的气泡稳定性提高53.11%。Abstract: Camellia oleifera seed meal as the main by-product of tea oil production, contains a large amount of unused high-quality plant protein. To explore the effects of ultrasound and enzyme treatment on protein during the extraction process, alkali dissolves acid precipitation (ADAP), enzyme extraction (EE), ultrasonic alkali dissolving acid precipitation (UADAP) and ultrasonic enzyme extraction (UEE) were used to extract protein from Camellia oleifera seed meal, and the structural and functional properties of the protein were compared and analyzed. The results showed that after ultrasonic treatment, the infrared peak of the amide I band shifted from 1629 cm−1 to 1649 cm−1, and the exposure of Trp residues within the protein molecules led to an increase in the fluorescence intensity of the protein. The proportion of ionic bonds in the intermolecular force increased to 31.17%. However, enzymatic treatment and alkali soluble acid precipitation treatment had little impact on the structure of protein, and there was no significant difference between the two methods. Through the comparison between ADAP group and UADAP group, it could be found that the emulsification, the gel hardness and the gel elasticity of protein increased by 34.43%, 51.36% and 38.13% after ultrasonic treatment, respectively. From the results of ADAP and EE groups, it was found that the emulsifying stability and foaming ability of the protein increased by 93.35% and 44.28% by enzymatic treatment, respectively, while the bubble stability of the protein increased by 53.11% after alkali soluble acid precipitation treatment.
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Keywords:
- Camellia oleifera seed meal /
- protein structure /
- ultrasonic /
- foaming /
- emulsibility /
- gellability
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油茶（Camellia oleifera Abel.）被誉为“东方橄榄油”，是世界四大木本油料作物之一[1-2]，富含不饱和脂肪酸90%，具有一定的预防心血管疾病的能力；同时还含有茶多酚、鱼鲨烯等多种活性成分，具有抗氧化、调节免疫功能、美容养颜等功效[3]。截止到2020年，全国油茶种植面积将已达6800万亩，油茶总产值达1160亿元。随着油茶产量的不断增加，油茶生产过程后的废弃物残渣也日趋益增多。而油茶饼粕除了含有脂肪外，还有大量的蛋白质、多糖、多酚、茶皂素等可以开发利用[4]。其中含量较多的油茶籽粕蛋白质主要以谷蛋白和清蛋白为主，具有优秀的体外抗氧化及金属离子螯合能力[5]，是一种优质的植物蛋白源，具有较高的开发利用价值。
近年来，蛋白主要提取方式大致有三类：碱溶酸沉水提、酶前处理辅助法或超声。丁丹华等[6]对油茶籽粕进行了碱溶酸沉处理，得到了57.8%的蛋白质提取率。何玮等[7]在碱溶酸沉法的基础上，利用淀粉酶和纤维素酶对油茶粕进行酶解预处理，蛋白质的提取率为80.36%，可以看出合适的两两结合的提取方法要比单个方法提取率高。曾琳等[8]采用碱溶酸沉法提取得到油茶籽粕蛋白，发现其对大豆蛋白凝胶具有增强作用，陈艺婷采用超声波辅助碱溶酸沉法得到油茶籽粕蛋白，对其进行食品功能性分析，发现在50 ℃起泡性最佳，60 ℃乳化性最好[9]。可以看出不同的处理方式得到的油茶籽粕蛋白在功能特性上也有一定的差异，而造成这一差异的原因，则是不同处理方式对蛋白结构带来的变化。Jambrak等[10]发现了超声波会破坏大豆蛋白的聚集体，使其分子间作用力产生变化，导致β-折叠含量减少，无规则卷曲含量升高，二硫键断裂，游离巯基增多等现象。但目前为止，还未有人对处理方法为油茶籽粕蛋白带来的影响进行深入分析。
因此，本文在以上研究的基础上，选择碱溶酸沉法、酶解（预处理）法、超声碱溶酸沉法、超声酶解法方法分别提取油茶籽粕蛋白质，并对比不同处理方法所得蛋白质之间的结构及功能差异，探明工艺条件对油茶籽粕蛋白提取物的影响，为未来实际应用方向提供理论依据，提高地方资源利用效率。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
油茶籽粕 信阳崧润茶油有限公司；石油醚（30~60 ℃） 天津市大茂化学试剂厂；纤维素酶（≥400 U/mg）、Tris三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白 上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶（10000 U/mg） 合肥巴斯夫生物科技有限公司；EDTA乙二胺四乙酸 天津市登封化学试剂厂；DTNB 2-硝基甲酸 合肥巴斯夫化工有限公司；尿素 天津市致远化学试剂有限公司；甘氨酸 郑州派尼化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷 天津市科密欧化学试剂有限公司；所有试剂均为国产分析纯。
Scientz-IID超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；FD-1A-80冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；ST-04凯氏定氮仪 山东盛泰仪器有限公司；DZKW-0-2电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；JXN-26高效离心机 贝克曼库尔特（美国）股份有限公司；A390紫外分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；iS5傅里叶变换红外光谱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Cary Eclipse荧光光谱仪 苏州市莱顿科学仪器有限公司；D160均质分散机 信钰仪器（北京）有限公司；DHG9240A（101A-36）电热鼓风干燥箱 上海比朗仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 油茶籽粕预处理
油茶饼粕经干燥之后，磨碎过120目筛，用1:3石油醚回流洗去原料中剩余油脂，脱脂后在通风橱中室温风干。然后再用10倍体积的70%乙醇浸润除去原料中的茶皂素，100 W超声10 min，过滤，取出滤渣，在通风橱内自然晾干后得到脱脂脱皂后的油茶饼粕。
1.2.2 不同方法提取油茶籽粕蛋白
ADAP组：参照丁丹华等[6]和熊拯等[11]的实验结果：处理后的油茶籽粕研碎过100目筛，和NaOH溶液的比例为1:20，pH10，浸提温度45 ℃，浸提时间120 min后离心取上清液，上清液调节pH至蛋白质的等电点，pH为3.0，静置1~2 h后，离心取沉淀，水洗至pH为7，离心冷冻干燥后保存。
EE组：根据前期实验结果，添加淀粉酶2.5%、纤维素酶0.9%，溶解于0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液，调整pH至4.5，酶解温度50 ℃，酶解时间150 min的条件下进行酶预处理，灭酶处理后按照ADAP组方法提取油茶粕中的蛋白质。
UADAP组：根据前期实验结果，在ADAP组的条件下采用350 W功率的超声波连续处理60 min。
UEE组：在EE组的酶解阶段采用350 W功率的超声波连续处理60 min，灭酶处理后按照ADAP组方法提取油茶粕中的蛋白。
1.2.3 蛋白质纯度测定
参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法，测定提取出来的油茶饼粕蛋白的含量。
1.2.4 红外光谱分析
将干燥后的油茶饼粕蛋白样品在玛瑙研钵中研磨成均匀的细粉，选择ATR模式，使用FT-IR扫描40~4000 cm−1。在4 cm−1分辨率、32次扫描的情况下收集信号，使用OMNIC6.0软件对数据收集后进行光谱数据分析。
1.2.5 荧光光谱分析
参照朱颖等[12]的测定的方法稍作修改，称取适量处理前后的油茶饼粕蛋白样品分散于0.01 mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度为1 mg/mL的蛋白溶液。利用荧光光度计，在280 nm的激发波长和350 nm的发色波长下，扫描速率为20 nm/s，发射光谱为300~450 nm。激发缝宽度为5 nm，发光窄缝宽度为5 nm。
1.2.6 分子间作用力检测
参照Yuan等[13]的检测方法，使用不同的溶剂破坏蛋白质分子之间的各种相互作用力，并做空白对照。在四个溶剂中连续溶解样品：0.6 mol/L氯化钠（S1）；0.6 mol/L氯化钠+1.5 mol/L尿素（S2）；0.6 mol/L氯化钠+8.0 mol/L尿素（S3）；0.6 mol/L氯化钠+8.0 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇（S4）。料液比为1:10，充分搅拌溶解后，10000 r/min离心20 min。上清蛋白含量用考马斯亮蓝法测定（上清液稀释10倍）。将每个S4组分在室温下用S1透析溶液24 h（磁力搅拌2 h），以避免β-巯基乙醇的干扰。结果以每部分相对于总蛋白质的百分比表示。以溶解于S1的蛋白含量来表示离子键的贡献，以溶解于S2的蛋白含量来表示氢键的贡献，在S3蛋白质中溶解的程度代表疏水键的作用，在S4蛋白质中溶解的二硫键作用。
分子间作用力=CSC0 式中：Cs：S1，S2，S3，S4溶液中蛋白浓度（g/mL）；C0：空白对照组中蛋白浓度（g/mL）。
1.2.7 溶解性测定
参考彭志杰等[14]的测定溶解性的方法稍作修改，在室温下，将0.2 g试样在20 mL水溶液中分散，搅拌30 min后将pH调整到中性，然后继续搅拌30 min，然后离心（5000×g，10 min），离心后取适量上清液稀释，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，计算上清液蛋白含量，溶解度为上清蛋白质量与样品总蛋白质量的比值。
1.2.8 乳化性及乳液稳定性测定
参考何玮等[15]的测定乳化性的方法稍作修改：称取0.06 g油茶粕蛋白样品溶解于0.1 mol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，25 ℃放在振荡器摇动30 min后加入3 mL花生油，然后在10000 r/min的条件下均质乳化2 min，用标准移液枪从试管底部吸取均匀乳状液50 μL，立刻与5 mL浓度为0.1% SDS漩涡混合反应5 s（用SDS溶液作为空白对照），在500 nm处测量吸光度B0。待放置10 min后，再次从底部吸取相同量的乳化液与5 mL的SDS溶液混和均匀，反应充分后在500 nm处测定此时的吸光度B1，乳化性及乳液稳定性按下列公式计算：
乳化性 (m2/g)=2×2.303×B0×DFC×φ×(1−γ)×10000 式中：C：稀释前蛋白浓度（g/mL）；φ：光程（1 cm）；γ：均匀乳液的油的体积分数（0.25）；DF：稀释倍数（100）；B0：0 min时在样液500 nm时的吸光度。
乳液稳定性(min)=B0B0−B1×10 式中：B0为500 nm处0 min时的吸光值；B1为500 nm处10 min时的吸光值。
1.2.9 起泡性及起泡稳定性测定
参照吴兴雨等[16]的测定起泡性及起泡稳定性的方法稍作修改，用0.01 mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制1%的蛋白溶液，然后使用均质机在转速10000 r/min下均质2 min，迅速转入量筒，记录溶液的起始体积和气泡的总体积，计算起泡性，公式如下：
起泡性(%)=气泡体积溶液起始体积×100 将均匀成型的气泡静止30 min后读取气泡的体积，记录下来，记录并计算出起泡30min的稳定性，其计算公式如下：
起泡稳定性(%)=30min后剩余的气泡体积气泡起始体积×100 1.2.10 凝胶性测定
凝胶制备：参考贾娜等[17]的蛋白制备稍作修改，将油茶籽蛋白分散液调配到合适的浓度，装于合适的密封的玻璃瓶中，放在85 ℃水浴锅中加热25 min，形成凝胶之后将玻璃器皿取出，放在冰浴中冷却，制成的凝胶放在冰箱的保鲜层处贮存备用。
质构测定：参考周建中[18]的棉籽蛋白凝胶测定实验方法并稍加改动。将凝胶试样切成尺寸大小一致的方形，放置在质构仪上，使用直径12 mm（P/12）的探头，用TPA方式测量（主要参数：测量前和测量时的速度分别为2.0和1 mm/s；下压距离（形变量）为50%，对每一种试样都进行测试，记录凝胶的硬度、弹性和粘附性。
凝胶保水性的测定：参考刘竞男等[19]的方法稍加改动。取一定凝胶置于离心管中，记录凝胶质量m，离心管和凝胶总质量m1，4000 r/min离心10 min后，用擦镜纸拭去离心管内甩出的水分，准确称量离心管及凝胶质量，记为m2，保水性按下式计算结果。
凝胶保水性 (%)=m−(m1−m2)m×100 式中：m：凝胶质量，g；m1：离心管和凝胶的质量，g；m2：离心后拭去水分的剩余凝胶和离心管质量，g。
1.3 数据处理
所有数据均重复三次试验结果，采用office软件记录计算，SPSS21.0软件进行数据分析，Origin Pro 9.6作图。
2. 结果与分析
2.1 不同提取工艺对油茶饼粕蛋白结构性质的影响
2.1.1 红外光谱分析
ADAP、EE、UADAP、UEE四种方法所得蛋白的纯度分别为75.50%、76.65%、78.90%、79.37%。对四种样品进行红外光谱分析，对比其结构性质之间的差异。结果发现，对于蛋白质而言，其主要特征峰为代表了碳氧双键伸缩振动的酰胺I带（1600~1700 cm−1），代表vN-H伸缩振动及δ N-H弯曲振动的酰胺II带（1480~1575 cm−1），代表C-N吸收带的酰胺III带（1200~1420 cm−1），这些都反应了肽键的存在。其中酰胺I带反应了蛋白质的主要二级结构的变化，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规则卷曲结构等。
如图1所示，四种方式提取所得油茶饼粕蛋白质的红外光谱图中，都能明显看到属于蛋白质的特征吸收峰，其中酰胺I带最为明显，除此之外，它们同时都在3200 cm−1附近出现宽峰，这代表了O-H的伸缩振动，代表了分子间或分子内存在的氢键[15]。经过超声波辅助处理，蛋白质的红外光谱图中，酰胺I带发生了红移，蛋白的二级结构中α-螺旋或者无规则卷曲含量增高。同时，不同的处理方法，都会使蛋白的结构发生变化。
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图 1 提取工艺对油茶籽粕蛋白红外光谱分析Figure 1. FT-IR spectrum analysis of Camellia oleifera seed meal protein by extraction process2.1.2 荧光光谱分析
含有芳香族氨基酸（色氨酸（tryptophan，Trp、酪氨酸（tyrosine，Tyr）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe））残基的蛋白质在280或295 nm的激发光的激发下会产生荧光，这种荧光称为内源性荧光（天然荧光）[20]。通过荧光光谱图可以有效的反映蛋白的三级结构，进而对蛋白分子间结构能更深入的分析。提取工艺对油茶饼粕蛋白荧光光谱分析由图2可知，不同提取工艺的油茶饼粕在354~356 nm处有峰值，油茶粕蛋白提取时与文献[21]相比发生了红移。当芳香发色团如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等处于极性的环境时，其最大吸收波长（λmax）会发生红移[22]。酶法处理对蛋白质发色基团的暴露效果弱于碱溶酸沉处理，但超声波处理会诱导蛋白质的展开，可能对生物酶活性产生了一定的影响，使其最大吸收波长（λmax）同样产生红移。Trp残基荧光强度的变化暗示着空间结构的变化，超声波处理会使包裹在蛋白质分子内部的Trp残基暴露出来，从而使蛋白质荧光强度升高[23]。由此可以分析出，超声波辅助处理和酶处理对蛋白三级结构均有影响，主要影响了蛋白质的疏水作用力和二硫键含量。
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图 2 提取工艺对油茶籽粕蛋白荧光光谱分析Figure 2. Fluorescence spectrum analysis of Camellia oleifera seed meal protein by extraction process2.1.3 分子间作用力分析
提取工艺对油茶饼粕蛋白离子键含量的影响由图3A可知，超声波辅助处理条件下，油茶饼粕蛋白质的高级结构发生了变化，大分子聚合体的解聚，使其平均颗粒尺寸减小，分子结构发生局部扩展，使含电位的氨基酸残基更多地暴露在分子表面，从而促进了离子键的生成。
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图 3 提取工艺对油茶籽粕蛋白化学键含量的影响Figure 3. Effects of extraction technology on the content of protein chemical bonds in Camellia oleifera seed meal protein提取工艺对油茶饼粕蛋白氢键含量的影响由图3B可知，在超声波辅助处理作用下，由超声波引起的温度变化，致使氢键的断裂，引起油茶饼粕蛋白质的高级结构被破坏。张文等[24]通过对花生蛋白分子结构的研究，发现超声的能破坏其内部的氢键，从而改变其二级结构。酶法处理与碱溶酸沉处理的氢键含量差别不大，超声波的作用是蛋白氢键含量变化的主要因素，并影响到了蛋白二级结构的变化。
提取工艺对油茶饼粕蛋白疏水相互作用的影响由图3C所示，疏水相互作用的减少是由于超声处理使蛋白质的结构展开，大的聚合体解聚，导致分子内封闭的疏水氨基酸残基减少。长时间超声处理后，疏水相互作用收到了较大的破坏[25]，图2中荧光光谱图的数据分析也体现出超声辅助处理条件下疏水作用力降低，酶法处理与碱溶酸沉法对分子间作用力的影响仍不是很明显。
提取工艺对油茶饼粕蛋白二硫键含量的影响如图3D所示，超声波辅助处理条件下，二硫键含量减少，可能是由于超声场下溶液中存在空穴，当压力变化时，空穴会交替地膨胀、断裂，从而协助改变分子内的结构[26]。二硫键的破坏会导致蛋白的构象发生变化，导致其结构疏松，并增加亲水性基团，增加了可溶性，与荧光光谱图分析得出的结果一致。
2.2 不同提取工艺对油茶饼粕蛋白功能特性的影响
2.2.1 溶解性分析
图4为不同提取方式油茶粕蛋白的溶解度，由图4可看出，四种提取方式提取出来的油茶饼粕蛋白质，其溶解度都能在75%以上，其中超声辅助酶解法与超声碱溶酸沉法的基本持平，经过超声辅助处理后，蛋白质的溶解性有一定的提升，可能超声波的空化作用破坏了蛋白质内部的二硫键，蛋白质分子展开，肽键结构容易疏松，水合作用增强，溶解度增加[27]。还有可能是蛋白质与油茶籽粕中残留的多酚形成了难溶的醌类物质[28]，而随着处理方式的改变，蛋白纯度增加，溶解度随着增加。
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图 4 不同提取方式油茶籽粕蛋白的溶解度Figure 4. Protein solubility of Camellia oleifera seed meal proteinin different extraction methods 2.2.2 乳化性及乳化稳定性分析
由图5可知茶粕蛋白的乳化性均在16 m2/g以上，与市场销售的大豆蛋白乳化性接近，尤其经过超声酶解提取的蛋白的乳化性最优。可能是由于超声处理过程中发生均匀的机械性震荡，蛋白质分子部分展开，油水界面聚集了很多小分子，降低了表面张力，蛋白颗粒减小更易解折叠及快速在油-水界面上稳定，从而提高了乳化性[29]，一般蛋白质的溶解度与其乳化性为正相关[27]，这与溶解度的结果一致。
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图 5 不同提取方式油茶籽粕蛋白质的乳化性及乳液稳定性Figure 5. Emulsifying properties and emulsion stability of Camellia oleifera seed meal protein by different extraction methods由图5可以看出碱溶酸沉提出的蛋白质乳化稳定性在30%±2.34%，图6可知其在30min后就出现了明显分层，而其他两种经过酶预处理的蛋白提取物的乳化稳定性可以达到60%±2.89%，在30 min后轻微分层，可能经过酶预处理后可以去掉皂类等杂质，提取所得的蛋白更完全，纯度更高，小分子基团暴露得多，增加了其在油水界面的吸附能力，使得水相与油相之间混合稳定，不容易发生分层[30]。
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图 6 乳化起始与乳化30min后的油茶籽粕蛋白注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。Figure 6. Camellia oleifera seed meal protein at the beginning of emulsification and after 30 minutes of emulsification2.2.3 起泡性与起泡稳定性分析
蛋白起泡性的本质是在特定的环境下，蛋白质与空气和水分形成的一种特殊的混合形式。影响蛋白质起泡的因素有很多，由图7可知超声辅助酶解提取的蛋白质的起泡性最高，酶解次之，图8展示了起始泡沫的情况，可以清晰地看出酶解处理的两组蛋白质拥有更好的起泡性，可能是淀粉酶与纤维素酶预处理去除了糖类等杂质，让蛋白分子间可以更加充分地接触，增强蛋白间的交互作用。也有研究指出，蛋白经超声处理可以解聚成小分子亚基，增加了气水界面的蛋白分子的量，起泡能力会有所提高[31]。超声处理还会导致蛋白质粒径减小，溶解度增大，展开的柔性蛋白在气-水界面快速吸附并重排，改善蛋白的起泡性[32]。由图7也可以看出，超声处理提高了蛋白的起泡性，这与毕爽等[33]的研究结果一致。
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图 7 不同提取方式油茶籽粕蛋白的起泡性Figure 7. Blistering of Camellia oleifera seed meal protein in different extraction methods在图8中气泡起始状态与放置30 min后的状态对比后可以发现，二者的气泡稳定性趋势是一致的，由图9可知超声辅助碱溶酸沉组最稳定，其次为碱溶酸沉组。可能是碱溶酸沉的处理方式会使提取物中残留少量糖类，碳水化合物的羰基与赖氨酸残基中ε-氨基或N-末端氨基形成一定程度的交联，生成偶联物，改善蛋白质的泡沫性质[34-35]，使形成的气泡表面粘度增大，增强气泡的稳定性，另一方面可能是由于超声条件比较适合，使蛋白质内部结构的展开程度较为合适，使气泡的空气-水界面上的薄膜更具粘弹性[36]。在殷春燕等[37]的实验结果下可知超声在一定程度上能够改善蛋白质的起泡性，但对气泡稳定性的影响结果并不一致。因此在实际应用中应根据要求选择合适的超声辅助提取条件，以获得具有良好起泡性和气泡稳定性的蛋白质。
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图 8 起泡起始与放置30min后的油茶籽粕蛋白气泡注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。Figure 8. Camellia oleifera seed meal protein bubble at bubble initiation and placement for 30 min![]()
图 9 不同提取方式油茶粕蛋白的气泡稳定性Figure 9. Bubble stability of Camellia oleifera seed meal protein in different extraction methods2.2.4 凝胶特性分析
2.2.4.1 质构分析
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图 11 不同提取方法油茶籽粕蛋白的凝胶质构特性Figure 11. Gel texture characteristics of Camellia oleifera seed meal protein extracted by different methods蛋白凝胶是一种具有一定弹性的半固体的胶态系统，它是由蛋白质和蛋白质的相互作用而形成的。在浓度适当的情况下，经过加热和冰水浴后得到了如图图10所示的四种蛋白凝胶，通过质构仪检测其性质，通过图11可以看到凝胶的硬度、弹性和粘附力均一般，通过超声处理，凝胶的硬度及弹性均得到一定的改善。刘冉等[38]的研究超声波对大豆分离蛋白凝胶形成的影响中表明，中功率的超声（200~600 W）可以改善大豆分离蛋白的凝胶性能，加速凝胶形成，中功率超声波处理可以提高大豆分离蛋白的凝胶黏弹性能。而叶钰等[39]在研究超声波加工对蛋清蛋白质结构和凝胶特性的影响中也发现200和400 W的超声波辅助处理可以使蛋白蛋清形成致密的、弹性更好的的蛋白凝胶。但过高的超声功率处理则会使蛋清的凝胶强度显著降低，从而使凝胶的稳定性降低。试验中的300 W提取功率属于中功率，所以会对蛋白质形成的凝胶造成一定的促进作用。
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图 10 不同提取方法的油茶粕蛋白凝胶注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。Figure 10. Camellia oleifera seed meal protein gels with different extraction methods2.2.4.2 保水性分析
由图12可知，四种方法所得蛋白质凝胶的保水性都在24%以上，其中超声辅助碱溶酸沉的最高，可能原因是声波能够适当促进凝胶的形成，使蛋白分子之间相互影响，形成更坚实的凝胶网络分子[38]。除了超声这些机械外在因素会对凝胶保水性造成影响外，温度、盐离子、pH等也会对保水性产生较大的影响，李亚楠等[40]在对鸭肉肌原纤维蛋白凝胶保水性的研究中指出在一定范围内pH越靠近等电点，则其凝胶的保水性越差。整体而言，碱溶酸沉法蛋白的凝胶保水性效果较酶解法好，可能是由于酶解时的pH位于等电点附近，致使凝胶的保水性降低。
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图 12 不同提取方法油茶粕蛋白的凝胶保水性Figure 12. Gel water retention of Camellia oleifera by different extraction methods3. 结论
本研究主要通过四种工艺提取油茶籽粕粗蛋白，并对粗提物的结构及功能特性进行初步探究，发现超声波处理会使油茶饼粕蛋白质的二级结构产生变化，诱导蛋白质的展开和荧光强度升高，使离子键含量的占比提升，乳化性、起泡性及蛋白质凝胶的硬度及弹性均有不同程度的提高；酶处理得到的蛋白质则会具有较好的乳化稳定性，以及较好的起泡性；而碱溶酸沉处理得到的蛋白质会具有更好的气泡稳定性，可以看出不同提取方法得到的油茶籽粕蛋白在功能特性上有着较为明显的差异性。依据本文内容，可从油茶籽粕蛋白质不同适用性上选择合适的工艺方法，为油茶籽粕蛋白的实际应用提供理论依据。但本研究的提取方法较为粗糙，只进行了初步比较，下一步可通过优化提取工艺，进一步提高油茶籽粕蛋白的提取率及功能特性，开发相关实际应用食品，并对其中的作用机理进行深入探究。
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图 1 提取工艺对油茶籽粕蛋白红外光谱分析
Figure 1. FT-IR spectrum analysis of Camellia oleifera seed meal protein by extraction process
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图 2 提取工艺对油茶籽粕蛋白荧光光谱分析
Figure 2. Fluorescence spectrum analysis of Camellia oleifera seed meal protein by extraction process
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图 3 提取工艺对油茶籽粕蛋白化学键含量的影响
Figure 3. Effects of extraction technology on the content of protein chemical bonds in Camellia oleifera seed meal protein
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图 4 不同提取方式油茶籽粕蛋白的溶解度
Figure 4. Protein solubility of Camellia oleifera seed meal protein
in different extraction methods ![]()
图 5 不同提取方式油茶籽粕蛋白质的乳化性及乳液稳定性
Figure 5. Emulsifying properties and emulsion stability of Camellia oleifera seed meal protein by different extraction methods
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图 6 乳化起始与乳化30min后的油茶籽粕蛋白
注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。
Figure 6. Camellia oleifera seed meal protein at the beginning of emulsification and after 30 minutes of emulsification
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图 7 不同提取方式油茶籽粕蛋白的起泡性
Figure 7. Blistering of Camellia oleifera seed meal protein in different extraction methods
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图 8 起泡起始与放置30min后的油茶籽粕蛋白气泡
注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。
Figure 8. Camellia oleifera seed meal protein bubble at bubble initiation and placement for 30 min
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图 9 不同提取方式油茶粕蛋白的气泡稳定性
Figure 9. Bubble stability of Camellia oleifera seed meal protein in different extraction methods
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图 11 不同提取方法油茶籽粕蛋白的凝胶质构特性
Figure 11. Gel texture characteristics of Camellia oleifera seed meal protein extracted by different methods
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图 10 不同提取方法的油茶粕蛋白凝胶
注：a. ADAP组；b. EE组；c. UADAP组；d. UEE组。
Figure 10. Camellia oleifera seed meal protein gels with different extraction methods
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