Process Optimization and Quality Change of Collagen-protein Edible Fungus Compound Sausage During Storage
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摘要: 为了研究胶原蛋白及食用菌等原料的复配比例对牦牛肉灌肠产品品质的影响及其贮藏过程中的品质变化，并确定牦牛肉灌肠的最佳加工工艺。本研究以牦牛肉灌肠为试验对象，以牦牛蹄筋、香菇、食盐和黄酒等添加量为影响因素，在单因素实验基础之上，以感官评分为响应值，利用响应面法（Box-Behnken）进行四因素三水平的响应面分析试验，并建立二次多项回归模型。在此基础上进行牦牛肉香肠的贮藏试验，测定分析其在4 ℃条件下贮藏0、2、4、6、8、10 d食用品质和流变特性等指标变化。结果表明，胶原蛋白食用菌香肠的最佳工艺配方为香菇添加量10%、黄酒添加量2%、牦牛蹄筋添加量20%、食盐添加量2%，此时牦牛肉香肠的评分最高（78.23），品质最佳。贮藏试验结果表明，随着贮藏时间的延长，牦牛肉香肠的持水力（WHC）、pH、L*值、a*值、硬度、咀嚼性、回复性逐渐减小，b*值、蒸煮损失随时间延长逐渐增大；内聚性、弹性变化不显著，流变特性变化显著（P<0.05）。由此可知，添加了胶原蛋白和食用菌经配方优化的牦牛肉灌肠在贮藏期间食用品质有一定的提升。Abstract: In order to study the effects of the complexity of raw materials such as collagen and edible fungi on the quality of yak meat enema products and the quality changes in the storage process, and to determine the best processing process of yak meat enema. The study took yak meat enema as the test object, with adding amounts such as yak hoof tendons, shiitake mushrooms, salt and rice wine as the influencing factors. A four-factor, three-level response surface analysis test was conducted using the Box-Behnken method with the sensory evaluation as the response values and a quadratic multinomial regression model was developed based on a single-factor experiments. On this basis, the storage test of yak sausage was carried out, and the changes of edible quality and rheological properties of it were measured and analyzed after 0, 2, 4, 6, 8 and 10 days of storage at 4 ℃. The results showed that the optimal formula of collagen-edible fungi sausage was 10% shiitake mushrooms, 2% yellow rice wine, 20% yak tendon, and 2% salt. Meanwhile, the score of yak sausage was the highest and the quality was the best. The storage test showed that with the extension of the time, the water holding capacity (WHC), pH value, L* value, a* value, hardness, chewiness and recovery of yak sausage gradually decreased, while the b* value and cooking loss gradually increased. Cohesiveness and elasticity did not change significantly, but rheological properties changed significantly (P<0.05）. In conclusion, the optimized formula of yak sausage supplemented with collagen and edible fungi could improve the edible quality during storage.
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Keywords:
- yak meat enema /
- response surface optimization /
- collagen /
- edible fungus /
- storage quality
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牦牛蹄筋位于牦牛脚掌部位，呈块状，产量较少，是珍贵的食物原料之一。牦牛蹄筋胶原蛋白含量较为丰富（约19%），且具有高钙、高蛋白、低脂肪不含胆固醇的营养特点，对于增强细胞的生理代谢有一定的作用[1]，本试验主要使用牦牛蹄筋中的胶原蛋白作为原料应用于香肠工艺优化。食用菌在我国种类繁多，常见的有香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳等，其含有丰富的营养物质，是一种药食兼用的食物[2]。其中香菇富含氨基酸、维生素、多糖等多种营养物质，且具有高蛋白低脂肪的特点[3]，肉质肥厚细嫩，味道鲜美，香味独特，营养价值高。
胶原蛋白是一种生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分。由于胶原蛋白具有保健功能、良好的染色性等，已被广泛应用于食品领域。将胶原蛋白添加至肉制品里，可以改善肉制品的嫩度。经过断裂胶原蛋白分子里的氢键，使原本的超螺旋结构遭到破坏，生成结构较为疏松、分子较小的明胶，使肉制品的肉质嫩度及其食用价值得以提高，蛋白质含量增加，既有良好的口感又具有丰富的营养[4]。胶原蛋白广泛应用于香肠制作，Meullenet等[5]研究显示，添加2%胶原量、20%水时，腊肠的感官、质地和口感最好。Schilling等[6]研究表示在腌制猪肉中利用猪肉胶原蛋白可以提高保水能力，并有可能改善产品的蛋白质功能特性。李秀羿[7]通过对多种食用菌的实验发现，将鲜香菇应用到猪肉香肠的生产过程中，可以有效降低猪肉香肠的亚硝酸盐残留量，并在香菇添加量为10%时感官评分最高。我国牦牛肉资源丰富，与之相对应的牦牛蹄筋资源也较为可观[8]，但是对于牦牛蹄筋的深加工研究比较少，到目前为止牦牛蹄筋在香肠制品中的应用也不多，有关食用菌添加量对牦牛肉香肠品质影响的研究以及添加多种复合物优化牦牛肉灌肠配方的研究较少。我国牛肉香肠制品的加工市场没有完整和系统的分类，对于牛肉的原料及处理没有准确的标准[9]。种种问题有待解决，在未来的研究及工作中还应该优化牛肉香肠的加工工艺，研究胶原蛋白及食用菌等原料的复配比例对牦牛肉灌肠产品品质的影响及其贮藏过程中的品质变化对于优化牦牛肉灌肠加工工艺具有重要意义。
本试验以牦牛肉灌肠为研究对象，探究牦牛蹄筋添加量、香菇添加量、食盐添加量、黄酒添加量等对此胶原蛋白食用菌复配香肠的食用品质的影响。通过单因素试验探究单一变量对于牦牛肉肠的品质影响，选出该变量对于牦牛肉香肠品质影响的最佳添加量，通过响应面试验优化，选择出最佳配比，以确定牦牛肉香肠的最佳工艺条件，并探究其在储藏过程中的品质变化，从而得到优质的胶原蛋白食用菌复配香肠。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜牦牛肉 购于四川省阿坝州红原县永源肉业，选取自然放牧状态下3岁龄左右健康无病牦牛背最长肌；猪肠衣、香菇、牦牛蹄筋、食用盐、黄酒、生抽、马铃薯淀粉、味精、胡椒粉、白砂糖、五香粉、水、肥牛肉、姜、卡拉胶 购于成都武侯区民生洗面桥菜市场。
5810-R 冷冻离心机 德国艾本德股份有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；TA-XT-Plus 食品物性分析仪 英国Stable Micro System公司；DHR-1混合动力流变仪 Waters LLC；CR-400 色差仪 日本柯尼卡美能达Konica Minolta。
1.2 实验方法
1.2.1 牦牛肉香肠的制作
参考文献[10]方法，将牦牛瘦肉、肥肉质量比为10:3，按照质量分数及实验需求添加不同量的食盐、香菇（涨发后的香菇）、黄酒、牦牛蹄筋、白砂糖1%、胡椒粉0.8%、马铃薯淀粉10%、味精0.3%、卡拉胶0.2%、五香粉0.1%、水15%、姜粉1%、生抽4%，其中所有配料的添加量均为牦牛瘦肉的质量分数。
1.2.2 牦牛肉肠加工工艺
参考文献[11]方法，按照配方准确称量新鲜干净的牦牛肉和配料，将牦牛肉切成小块，加入辅料，腌制30 min，分别将各添加组分混入腌制完毕的牦牛肉中混合均匀后搅碎，灌装成长度约为5 cm的肠体，用排气针扎眼排除肠内气体后置于4 ℃冰箱中贮藏，检测其在贮藏0、2、4、6、8、10 d中品质变化。
1.2.3 单因素实验设计
首先进行单因素实验，实验参数为：牦牛蹄筋添加量20%、香菇添加量15%、黄酒添加量2%、食盐添加量3%；然后分别对香菇添加量（0%、5%、10%、15%、20%、25%）、黄酒添加量（0%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、牦牛蹄筋添加量（0%、5%、10%、15%、20%、25%）、食盐添加量（0%、1%、2%、3%、4%、5%）4个因素进行单因素实验，以感官评分为指标，测定各因素对香肠感官品质影响。
1.2.4 响应面试验设计
根据单因素实验的结果，使用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计，进行Box-Benhnken中心组合设计，以香菇添加量（A）、黄酒添加量（B）、牦牛蹄筋添加量（C）、食盐添加量（D）四个因素为实验变量，以感官评分为响应值设计四因素三水平响应面试验，其中有29个试验点。根据响应面试验结果，确定牦牛肉肠的最佳工艺优化，响应面试验因素水平编码见表1。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Response surface test factor level水平 A（%） B（%） C（%） D（%） −1 10.00 1.50 15.00 2.00 0 15.00 2.00 20.00 3.00 1 20.00 2.50 25.00 4.00 1.3 测定指标
1.3.1 感官评价
根据GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》，选取10名经过食品感官专业训练的同学，对牦牛肉香肠进行感官评价，从香肠的色泽、滋气味、组织状态、口感、切片性等方面进行评价，每个参与评价的成员原则上不能进行沟通与交流。关于对于牦牛肉香肠的感官评价标准如表2。
表 2 牦牛肉香肠的感官评价标准Table 2. Sensory evaluation criteria for yak sausage等级 色泽 滋味和气味 组织状态 口感 切片性 16-~20分 呈鲜红色，色泽分明，有光泽 肉味鲜浓，香菇味淡，
咸淡适中，滋味鲜美各物质分布均匀，
有弹性口感细腻，咀嚼性好，
咸淡合适肉紧实，切片平整 10~15分 呈暗红色，色泽较分明，
有光泽肉味浓，香菇味较重，
无不良气味各物质结合较好，
弹性较好有一定的粗糙感，
咀嚼性一般肉较紧实，切片完整，
水分含量少0~10分 暗淡、无光泽，较难接受 香菇味过浓，有不良气味 弹性一般，松散 口感粗糙，咀嚼性差 肉质松散，切面不平整，湿润 1.3.2 蒸煮损失和持水性（WHC）
蒸煮损失：参考叶阳等[12]的方法并进行适当调整，将香肠样品置于蒸煮损失袋中，水浴加热至中心温度达75 ℃，煮制30 min，取出后冷却到室温，然后擦去香肠表面的水分，进行称量，并根据相应的公式计算蒸煮损失率。
蒸煮损失率(%)=m1−m2m1×100 式中：m1为样品蒸煮前的质量，g；m2为样品蒸煮冷却后的质量，g。
WHC：参照文献[13]的方法并进行适当调整。取3 g样品，记为m1，用吸水滤纸包裹，在8000 r/min下进行离心10 min，取出后滤干表面上的水分，然后进行称量，记为m2，根据公式计算WHC。
WHC(%)=(1−m1−m2m1)×100 式中：m1为离心之前样品的质量，g；m2为离心之后样品的质量，g。
1.3.3 pH
根据GB 5009.228-2016《食品安全国家标准-食品pH值的测定》方法测定。
1.3.4 色差值
将牦牛肉香肠进行切块，使用色差仪进行测量，用L*值、a*值、b*值分别表示香肠样品的亮度值、红度值以及黄度值，将每个样品平行测量4次
1.3.5 质构特性
参考赵春波等[14]的测量方法并根据实际情况调整，将香肠样品切成直径为18 mm，高为16 mm的片状，使用物性测试仪进行TPA测定。参数的设置为：探头：P/50，测前速度：2 mm/s，测试速度：0.8 mm/s，测后速度：0.8 mm/s，压缩比：75%，时间5 s。
1.3.6 流变特性
参考李应兰等[15]的方法，动态温度扫描条件：样品在25 ℃平衡3 min，扫描温度范围：25~80 ℃，变温速率为：2 ℃/min，80 ℃保温3 min。动态频率扫描条件：扫描范围：0.1~20 Hz，应变1%，并记录动态扫描期间的储能模量G'值的变化趋势。
1.4 数据处理
所有数据采用Microsoft 2016 Excel进行整理，试验中测定所得数据统计采用Design Expert8.06中的Box-Behnken设计响应面试验方案，用SPSS26.0进行数据显著性分析，P>0.05无显著性差异，P<0.05有显著性差异，P<0.01有极显著差异。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
由表3可以看出，香菇添加量为10%和15%时，香肠的感官评分显著高于其他添加量时的感官评分（P<0.05），且在15%时香肠的感官评分最高，品质最佳，原因可能是随着香菇添加量的提高，香肠的脂肪含量减小[8]，水分含量增加，蛋白含量降低[16]，香肠的硬度、内聚性、咀嚼性和弹性降低。适量的香菇改善了香肠的嫩度，而过量的香菇会导致香肠过软。在滋味与香气方面，由于香菇富含游离氨基酸，有助于增强香肠的滋味和风味特性[17]。但是当香菇添加量过高，香肠中会有轻微的特殊气味，是小组成员所不接受的。结合本试验结果，在香菇添加量为15%时，香肠的感官评价最佳。
表 3 牦牛牛肉肠制作单因素实验结果Table 3. Single factor experimental results of yak beef sausage production添加指标 组别 添加量（%） 感官评分（分） 香菇 1 0 61±0.82b 2 5 62±0.82b 3 10 68±1.41a 4 15 72±4.24a 5 20 61±2.16b 6 25 61±4.83b 黄酒 1 0 67±2.16b 2 1.00 70±6.48ab 3 1.50 73±1.83ab 4 2.00 75±4.76a 5 2.50 74±3.56a 6 3.00 72±4.08ab 牦牛蹄筋 1 0 64±3.56b 2 5 72±4.32a 3 10 72±4.08a 4 15 73±2.16a 5 20 74±2.16a 6 25 72±4.54a 食盐 1 0 69±5.35b 2 1 73±3.37ab 3 2 74±4.55ab 4 3 76±4.24a 5 4 72±4.24ab 6 5 68±1.63b 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 黄酒添加量为2%时，香肠的感官评分最高并与其他添加量对黄酒的感官评分无显著差异，但均显著高于未添加黄酒香肠的感官评分（P<0.05）。独特的原料及酿造工艺使得黄酒具有丰富的口感和醇香的风味[18]，Liu等[19]采用顶空固相微萃取法对黄酒中的挥发性物质进行萃取，采用气相色谱-质谱联用仪，通过气味活度值分析气味特征和强度，从酒样中共鉴定出64种挥发性化合物。黄酒中含有丰富的糖和氨基酸物质，在加热过程中发生了氨基酸的降解和美拉德反应，不饱和脂肪酸氧化形成的过氧化物裂解及糖类降解，也会产生比较重要的风味成分[20]。在色泽方面，黄酒会对香肠色泽有积极影响，这与朱文政等[20]的研究结果一致。若黄酒过量其风味过于浓郁反而会遮掩了牦牛肉特有的风味[21]，也会使香肠颜色过深。因此添加适量的黄酒于牦牛肉香肠中能够去除香肠中牦牛肉的腥味，增加醇香、焦糖香、果香等风味，提高色泽，从而提升牦牛肉香肠的感官，得到高品质的香肠。
添加牦牛蹄筋能够显著提高香肠的感官品质（P<0.05），且当添加量为20%时与其他添加量相比对香肠感官品质的影响无显著差异，此添加量下牦牛肉肠感官评分最高，感官品质最佳。牦牛蹄筋富含胶原蛋白，胶原蛋白具有共价键链接三股肽链的蛋白质，结构紧密，亲水力较差[22]，在香肠煮制加热的过程中，变性的胶原蛋白分子进行规律地排列，从而形成一种三维网状结构，使香肠的凝胶效果更好，由此，提高香肠的保水性，从而优化牦牛肉香肠的品质。
当食盐的添加量为3%时香肠所含挥发性风味物质的种类和含量最多，感官评分最高并显著高于未添加食盐与添加量为5%时的感官评分（P<0.05）。根据张秋会等[23]的研究，食盐含量的变化能够使香肠的保水性、自由水含量、出品率随之发生变化，降低食盐含量其保水性降低，自由水含量减少，出品率降低，与本研究结果一致，食盐含量在3%时，香肠的食用品质在最佳范围。但是食盐含量0%时香肠中也含有较多风味物质，可能是因为不加食盐的香肠中富含各种微生物[24]，一些微生物可以促进香肠的发酵，如乳杆菌属、片球菌属和链球菌属等[25]。
2.2 响应面结果与分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
根据单因素实验结果，以香菇添加量（A）、黄酒添加量（B）、牦牛蹄筋添加量（C）、食盐添加量（D）为试验因子；以牦牛肉香肠的感官评分（R1）为响应值，进行四因素三水平的Box-Behnken试验，响应面试验设计方案及结果见表4。
表 4 响应面试验结果Table 4. Response surface test results实验号 因素 感官评分（分） A B C D 1 0 −1 0 −1 76.75 2 1 0 0 1 76.25 3 0 0 −1 1 77.00 4 0 −1 −1 0 76.25 5 −1 0 0 1 75.75 6 0 0 0 0 78.00 7 0 1 0 1 75.75 8 −1 −1 0 0 75.75 9 −1 0 −1 0 76.50 10 0 0 1 −1 77.75 11 0 1 1 0 76.25 12 0 −1 1 0 76.00 13 0 0 0 0 78.25 14 1 1 0 0 75.50 15 0 0 −1 −1 76.75 16 0 −1 0 1 75.00 17 0 1 0 −1 76.00 18 1 −1 0 0 75.25 19 0 1 −1 0 76.50 20 0 0 0 0 78.25 21 −1 0 1 0 77.50 22 0 0 1 1 75.50 23 1 0 0 −1 76.75 24 0 0 0 0 77.75 25 0 0 0 0 78.00 26 −1 0 0 −1 77.25 27 1 0 1 0 75.75 28 1 0 −1 0 77.50 29 −1 1 0 0 75.25 2.2.2 模型回归及显著性分析
如表5中的方差分析表所示，对牦牛肉香肠的感官评分所建立的回归方程进行显著性检验，整体模型P<0.0001，表明该二次方程模型达到极显著，同时失拟项不显著（P>0.05），因此表明该回归方程对数据进行了较好的拟合。
表 5 四种因素复配比例对牦牛肉香肠感官评价影响的方差分析Table 5. Variance analysis of the effects of the combination ratio of four factors on sensory evaluation of yak sausage来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 模型 14 26.18 1.87 36.79 <0.0001 A 1 0.083 0.083 1.64 0.2212 B 1 0.0052 0.0052 0.10 0.7536 C 1 0.26 0.26 5.02 0.0418 D 1 3.00 3.00 59.03 <0.0001 AB 1 0.14 0.14 2.77 0.1184 AC 1 1.89 1.89 37.2 <0.0001 AD 1 0.25 0.25 4.92 0.0436 BC 1 0.000 0.000 0.000 1.000 BD 1 0.56 0.56 11.07 0.005 CD 1 1.56 1.56 30.75 <0.0001 A2 1 5.5 5.5 108.23 <0.0001 B2 1 14.88 14.88 292.8 <0.0001 C2 1 0.98 0.98 19.37 0.0006 D2 1 3.49 3.49 68.64 <0.0001 失拟项 10 0.54 0.054 1.23 0.4565 残差 4 0.17 0.044 总和 28 26.89 对试验结果进行回归分析，得到的二次多项方程：Y=78.05−0.083A+0.021B−0.15C−0.50B+0.19AB−0.69AC+0.25AD+0.000BC+0.37BD−0.63CD−0.92A2−1.51B2−0.39C2−0.73D2，R2=0.9735，校正系数RAdj=0.9471，说明该试验具有较好的拟合性，试验误差较小，对样品感官评价的预测准确性高。同时，由表5中可知，牦牛蹄筋添加量、食盐添加量的一次项对响应值影响均达到显著（P<0.05），所有二次项对响应值影响极显著（P<0.01），AC、AD、BD、CD的交互效应对响应值影响均显著（P<0.05）。
2.2.3 因素间交互作用分析
对试验自变量牦牛蹄筋添加量、香菇添加量、黄酒添加量、食盐添加量之间的两两交互作用进行分析，得到交互因子的响应面3D图（图1）。等高线和响应面反应两个变量之间交互作用，以及每个变量水平对响应值的影响程度[26]，响应曲面越陡则表明该自变量对响应值的影响作用越大，由此可知各试验变量间的交互作用对牦牛肉香肠感官评价的影响情况。如图1所示，牦牛蹄筋添加量曲面变化比香菇添加量曲面变化更陡峭，说明牦牛蹄筋添加量比香菇添加量对香肠感官评价的影响更显著，其结果与方差分析的结果相一致。而黄酒添加量所表现的响应曲面较为平缓，说明此因素对响应值影响较小，与回归分析数据一致。各因素之间有不同程度的交互作用，由强到弱依次是AC、CD、BD、AD、AB、BC，并且其中香菇添加量与牦牛蹄筋添加量的交互作用、牦牛蹄筋添加量与食盐添加量的交互作用以及黄酒添加量与食盐添加量的交互作用对响应值的影响极显著（P<0.01），这与方差分析结果相符。按照感官评分最高为优化条件，利用Design Expert8.06软件进行优化得到的牦牛肉香肠最佳配方为：牦牛蹄筋添加量为25%、香菇添加量为12.23%、黄酒添加量为1.93%、食盐添加量为2.10%，预测感官得分为78.23。
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图 1 不同变量添加量的交互作用对牦牛肉香肠感官的影响Figure 1. Effect of mushroom, yak tendon, yellow rice wine and salt on sensory perception of yak sausage2.2.4 验证试验
为了验证响应面法的可行性，比较预测值与测定值之间的准确性与差异性，考虑到操作实际的可行性，将参数调整为：牦牛蹄筋添加量25%、香菇添加量12%、黄酒添加量2%、食盐添加量2%，在此条件下进行对牦牛肉香肠进行试验验证，重复试验三次，取平均值。最终得到的产品感官评分为78.50分，与模型理论值接近，仅相差0.27分，表明该模型能够对实际值进行预测，该响应面法对牦牛肉香肠的工艺优化回归模型准确可靠，有一定应用价值。
2.3 贮藏期内香肠品质变化
2.3.1 贮藏期内香肠蒸煮损失和WHC变化
蒸煮损失可以反映香肠保持水分的能力，同时也是评定香肠品质的重要指标。由图2可知，贮藏过程中牦牛肉香肠的蒸煮损失率呈逐渐上升的趋势，且变化显著（P<0.05）。贮藏4 d时的蒸煮损失率显著高于贮藏0、2 d是的蒸煮损失率；贮藏6、8、10 d时的蒸煮损失率显著高于贮藏0、2、4 d时的蒸煮损失率（P<0.05）；但贮藏6、8、10 d的蒸煮损失变化不显著。出现上述结果的原因可能是香肠中的香菇在贮藏过程中其持水性降低，并且在烹饪过程中持水性随贮藏时间的延长而降低，从而导致蒸煮损失率增加[16]，在加热的过程中牦牛蹄筋中的胶原蛋白热变性，其结构由完整的三螺旋结构变为无定型的卷曲状结构，从而导致其保水能力下降，蒸煮损失率增加[27]。但是相较于普通香肠，本产品中含有一定量的牦牛蹄筋富含胶原蛋白，在蒸煮过程中胶原蛋白分布于蒸煮后的香肠表面或内部，形成一层膜，保留住香肠内的水分，从而使香肠的蒸煮损失的变化在贮藏过程中减缓[28]。
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图 2 贮藏期间香肠的蒸煮损失和WHC变化注：不同测定时间点小写字母不同表示差异显著（P<0.05）；图3同。Figure 2. Changes in steaming losses and WHC of sausages during storage肉制品的持水性是衡量肉制品品质的重要指标。香肠的持水性直接影响香肠嫩度、口感和弹性，因此持水性也是十分重要的指标[29]。由图2可知，香肠的持水力随着贮藏时间的延长显著下降（P<0.05），贮藏2、4、6 d的香肠持水力变化不显著；贮藏8与10 d香肠持水力变化不显著。分析原因可能是由于本产品中添加有牦牛蹄筋富含胶原蛋白，持水力与胶原蛋白分子量分布及凝胶网络结构有很大关系[30]，添加富含胶原蛋白的物质可以显著提高香肠的持水力，即在贮藏过程中可以减缓香肠持水力下降的速度。该结果与李星等[29]的研究结果一致，主要是因为胶原蛋白具有较强的吸水、保水性，在香肠干燥阶段胶原蛋白的这一特性使得香肠中水分不易过度蒸发。
2.3.2 贮藏期内香肠pH的变化
pH是反应香肠的品质的重要理化指标，通过分析在贮藏过程中pH的变化情况能够反映出香肠的颜色、持水力、嫩度等特性。由图3中可知，香肠的pH随着贮藏时间的延长整体呈显著下降变化。贮藏8 d时的pH显著低于其他贮藏时间的pH（P<0.05）。与自然发酵的香肠[31]对比发现，在贮藏一定时间后，复配香肠的pH显著低于自然发酵的香肠（P<0.05），其原因可能是香菇[8]和胶原蛋白[29]的添加提高了香肠的水分含量，促进了乳酸菌的生长，加速香肠的分解反应，产生有机酸，造成pH值下降；在贮藏10 d时的pH相较于贮藏8 d时的pH显著上升（P<0.05），该结果与Choe等[32]的研究结果一致，其可能的原因是食用菌的添加导致赖氨酸等碱性氨基酸含量提高[33]，而乳酸菌的活性逐渐减小，香肠中的蛋白质被分解产生碱性物质导致pH值增加[34]。Kanno等[35]研究表明，低pH能降低肉中蛋白质的持水能力，缩短香肠的发酵周期。适当的低pH可以比较有效的抑制微生物的生长，但是pH过低，也会使得香肠的品质受到影响[36]。非即食的香肠其pH的变化情况直接影响其货架期，因此pH是影响香肠品质的重要因素，在香肠制品的加工和制作时应给予重视。
2.3.3 贮藏期内香肠色差值的变化
由表6可以看出，牦牛肉香肠在贮藏期间，随着时间的延长其L*值整体趋势逐渐减小，即亮度逐渐降低，色泽变暗；a*值整体趋势随着贮藏时间逐渐减小，即红度值下降，肉色鲜红状态减弱；b*值整体趋势随着贮藏时间逐渐增加，即黄度值上升，色泽变黄，且L*、a*、b*值均变化显著（P<0.05）。与正常发酵的香肠相比，复配香肠b*值较高，这与孙金等[37]的研究结果一致，可能是香菇本身颜色较深，从而对肉色产生影响。随着贮藏时间延长，香肠保水率下降，肌红蛋白周围失水，与氧气反应生成高铁肌红蛋白，亚铁离子被氧化为3价铁离子形成红褐色高铁肌红蛋白[38]，L*值随之下降。合理的O2浓度能够使肉色保持稳定[39]，由此推断如表中的变化趋势可能的原因是储藏期间香肠保存环境O2浓度有所波动从而改变氧合肌红蛋白的生成，使得a*值呈现逐渐减小的趋势；在贮藏过程中香肠内的脂肪发生氧化作用，因此伴随着b*值的逐渐升高。
表 6 贮藏期间牦牛肉香肠色度的变化Table 6. Changes in the texture of yak meat sausages during storage贮藏天数（d） L*值 a*值 b*值 0 37.14±1.607b 11.59±0.561a 15.08±0.193b 2 36.78±0.193b 7.02±0.584d 14.70±0.361b 4 36.99±0.898b 11.73±0.631a 16.58±0.444a 6 39.84±1.394a 10.13±0.576b 16.57±0.498a 8 31.60±0.592d 8.67±0.075c 16.12±1.449a 10 33.79±0.862c 8.13±0.530c 16.95±0.435a 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.3.4 贮藏期内香肠质构特性的变化
质构是香肠食用品质的重要组成部分。其中硬度、弹性、内聚力、咀嚼性、回复性是反应香肠质构的重要指标。由表7可以看出，随着贮藏时间的延长牦牛肉香肠的硬度、咀嚼性、回复性均呈下降趋势，且变化显著（P<0.05），2 d的硬度显著高于0 d的硬度（P<0.05）；0 d的咀嚼性显著高于4、6、8、10 d的咀嚼性（P<0.05）；回复性在6 d最高；内聚性、弹性变化不显著。由上述关于WHC和蒸煮损失的分析中可以得香肠在储藏过程中蒸煮损失率增加、保水性下降，这些变化都与香肠在储藏期间内部结构的变化有关，内部结构变得松散水分流失多造成硬度下降；咀嚼性下降可能是由于随着贮藏时间的延长香肠中的蛋白质变性，脂肪水分流失，咀嚼性下降[40]。香肠的内聚性等无显著性变化的原因可能是香肠中添加牦牛蹄筋富含胶原蛋白，胶原蛋白形成凝胶后提高了香肠的保水性，稳固了香肠内部的结构[41]。
表 7 贮藏期间牦牛肉香肠质构的变化Table 7. Changes in coloration of yak meat sausages during storage时间（d） 硬度（g） 弹性 内聚力 咀嚼性（g） 回复性 0 772.70±244.58b 0.81±0.13a 0.45±0.23a 245.09±49.98a 0.08±0.02cd 2 965.43±44.56a 0.77±0.15ab 0.38±0.06ab 279.56±21.49a 0.11±0.02bc 4 476.83±47.48c 0.61±0.03b 0.46±0.02a 132.46±14.78b 0.14±0.01ab 6 515.80±79.09c 0.65±0.06ab 0.45±0.06a 151.40±33.53b 0.15±0.02a 8 427.39±98.17c 0.63±0.08b 0.29±0.08ab 80.49±37.74c 0.09±0.02cd 10 423.50±51.93c 0.63±0.12b 0.27±0.06b 68.00±10.47c 0.06±0.03d 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.3.5 贮藏期内香肠流变特性的变化
本试验主要研究在温度逐渐升高，动态流变的测量过程中，进行剪切时储能模量（G'）的变化情况，G'值指的是物质的弹性特征。由图4可以看出温度变化，不同贮藏时间的G'值变化趋势几乎相同，其G值'随着温度的升高逐渐减小，当温度升到60 ℃时，G'值降到最低值，随后随着温度的升高G'值开始缓慢增加。10 d时G'值的显著高于其他贮藏时间时的G'值（P<0.05）；贮藏0 d的G'值低于2、6、8、10 d时的G'值。通过温度扫描确定加热对于牦牛肉香肠的流变学影响，并根据毛云等[42]的研究表明G'值越高则香肠的凝胶效果越好，由图中可得牦牛肉香肠随着贮藏时间的延长其凝胶效果显著。分析图中的变化趋势，可能是加热的过程中肌原纤维蛋白质发生一系列的物化反应，蛋白质展开然后聚集导致[43]。前期随着温度的升高G'值下降的原因可能是香肠中各物质中的肌球蛋白空间结构转变分子流动性增强造成的或者香肠中蛋白质结构被破坏[44]。G'值的上升可能是因为蛋白质分子间形成凝胶结构。
3. 结论
响应面试验结果表明，将牦牛蹄筋、香菇、黄酒和食盐等复配后添加到牦牛肉香肠中后对香肠产品的感官品质具有显著影响；响应面试验及验证试验得出胶原蛋白食用菌复配香肠的最佳配方，牦牛蹄筋添加量为25%、香菇添加量为12.23%、黄酒添加量为1.93%、食盐添加量为2.10%。
贮藏实验结果表明，随着贮藏时间的延长香肠的蒸煮损失率呈先上升后下降变化，持水力和pH值整体呈显著下降变化，不同时间点香肠的色差值变化显著（P<0.05）；同时，贮藏期间香肠的硬度、咀嚼性和回复性变化显著（P<0.05），内聚性和弹性变化不显著；流变性变化显著。综上所述，本研究结果可为牦牛肉香肠的工艺优化提供理论参考和数据支持，便于提高牦牛肉资源的开发与利用。
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图 1 不同变量添加量的交互作用对牦牛肉香肠感官的影响
Figure 1. Effect of mushroom, yak tendon, yellow rice wine and salt on sensory perception of yak sausage
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图 2 贮藏期间香肠的蒸煮损失和WHC变化
注：不同测定时间点小写字母不同表示差异显著（P<0.05）；图3同。
Figure 2. Changes in steaming losses and WHC of sausages during storage
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Response surface test factor level
水平 A（%） B（%） C（%） D（%） −1 10.00 1.50 15.00 2.00 0 15.00 2.00 20.00 3.00 1 20.00 2.50 25.00 4.00 
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表 2 牦牛肉香肠的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria for yak sausage
等级 色泽 滋味和气味 组织状态 口感 切片性 16-~20分 呈鲜红色，色泽分明，有光泽 肉味鲜浓，香菇味淡，
咸淡适中，滋味鲜美各物质分布均匀，
有弹性口感细腻，咀嚼性好，
咸淡合适肉紧实，切片平整 10~15分 呈暗红色，色泽较分明，
有光泽肉味浓，香菇味较重，
无不良气味各物质结合较好，
弹性较好有一定的粗糙感，
咀嚼性一般肉较紧实，切片完整，
水分含量少0~10分 暗淡、无光泽，较难接受 香菇味过浓，有不良气味 弹性一般，松散 口感粗糙，咀嚼性差 肉质松散，切面不平整，湿润
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表 3 牦牛牛肉肠制作单因素实验结果
Table 3 Single factor experimental results of yak beef sausage production
添加指标 组别 添加量（%） 感官评分（分） 香菇 1 0 61±0.82b 2 5 62±0.82b 3 10 68±1.41a 4 15 72±4.24a 5 20 61±2.16b 6 25 61±4.83b 黄酒 1 0 67±2.16b 2 1.00 70±6.48ab 3 1.50 73±1.83ab 4 2.00 75±4.76a 5 2.50 74±3.56a 6 3.00 72±4.08ab 牦牛蹄筋 1 0 64±3.56b 2 5 72±4.32a 3 10 72±4.08a 4 15 73±2.16a 5 20 74±2.16a 6 25 72±4.54a 食盐 1 0 69±5.35b 2 1 73±3.37ab 3 2 74±4.55ab 4 3 76±4.24a 5 4 72±4.24ab 6 5 68±1.63b 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 4 响应面试验结果
Table 4 Response surface test results
实验号 因素 感官评分（分） A B C D 1 0 −1 0 −1 76.75 2 1 0 0 1 76.25 3 0 0 −1 1 77.00 4 0 −1 −1 0 76.25 5 −1 0 0 1 75.75 6 0 0 0 0 78.00 7 0 1 0 1 75.75 8 −1 −1 0 0 75.75 9 −1 0 −1 0 76.50 10 0 0 1 −1 77.75 11 0 1 1 0 76.25 12 0 −1 1 0 76.00 13 0 0 0 0 78.25 14 1 1 0 0 75.50 15 0 0 −1 −1 76.75 16 0 −1 0 1 75.00 17 0 1 0 −1 76.00 18 1 −1 0 0 75.25 19 0 1 −1 0 76.50 20 0 0 0 0 78.25 21 −1 0 1 0 77.50 22 0 0 1 1 75.50 23 1 0 0 −1 76.75 24 0 0 0 0 77.75 25 0 0 0 0 78.00 26 −1 0 0 −1 77.25 27 1 0 1 0 75.75 28 1 0 −1 0 77.50 29 −1 1 0 0 75.25
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表 5 四种因素复配比例对牦牛肉香肠感官评价影响的方差分析
Table 5 Variance analysis of the effects of the combination ratio of four factors on sensory evaluation of yak sausage
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 模型 14 26.18 1.87 36.79 <0.0001 A 1 0.083 0.083 1.64 0.2212 B 1 0.0052 0.0052 0.10 0.7536 C 1 0.26 0.26 5.02 0.0418 D 1 3.00 3.00 59.03 <0.0001 AB 1 0.14 0.14 2.77 0.1184 AC 1 1.89 1.89 37.2 <0.0001 AD 1 0.25 0.25 4.92 0.0436 BC 1 0.000 0.000 0.000 1.000 BD 1 0.56 0.56 11.07 0.005 CD 1 1.56 1.56 30.75 <0.0001 A2 1 5.5 5.5 108.23 <0.0001 B2 1 14.88 14.88 292.8 <0.0001 C2 1 0.98 0.98 19.37 0.0006 D2 1 3.49 3.49 68.64 <0.0001 失拟项 10 0.54 0.054 1.23 0.4565 残差 4 0.17 0.044 总和 28 26.89
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表 6 贮藏期间牦牛肉香肠色度的变化
Table 6 Changes in the texture of yak meat sausages during storage
贮藏天数（d） L*值 a*值 b*值 0 37.14±1.607b 11.59±0.561a 15.08±0.193b 2 36.78±0.193b 7.02±0.584d 14.70±0.361b 4 36.99±0.898b 11.73±0.631a 16.58±0.444a 6 39.84±1.394a 10.13±0.576b 16.57±0.498a 8 31.60±0.592d 8.67±0.075c 16.12±1.449a 10 33.79±0.862c 8.13±0.530c 16.95±0.435a 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 7 贮藏期间牦牛肉香肠质构的变化
Table 7 Changes in coloration of yak meat sausages during storage
时间（d） 硬度（g） 弹性 内聚力 咀嚼性（g） 回复性 0 772.70±244.58b 0.81±0.13a 0.45±0.23a 245.09±49.98a 0.08±0.02cd 2 965.43±44.56a 0.77±0.15ab 0.38±0.06ab 279.56±21.49a 0.11±0.02bc 4 476.83±47.48c 0.61±0.03b 0.46±0.02a 132.46±14.78b 0.14±0.01ab 6 515.80±79.09c 0.65±0.06ab 0.45±0.06a 151.40±33.53b 0.15±0.02a 8 427.39±98.17c 0.63±0.08b 0.29±0.08ab 80.49±37.74c 0.09±0.02cd 10 423.50±51.93c 0.63±0.12b 0.27±0.06b 68.00±10.47c 0.06±0.03d 注：同列含不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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