Optimization of Decolorization Process of Antarctic Krill Peptides by Response Surface Methodology
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摘要: 为优化南极磷虾蛋白肽脱色工艺，提高南极磷虾蛋白肽产品品质，采用活性炭吸附法脱除南极磷虾蛋白肽溶液中的色素，以脱色率和蛋白保留率为评价指标，分别考察活性炭用量、pH、脱色温度、脱色时间对脱色效果的影响，在单因素实验基础上，选择脱色温度50 ℃，采用响应面法优化南极磷虾蛋白肽脱色工艺。结果表明，采用粉末活性炭吸附脱除南极磷虾蛋白肽色素的最佳条件为：活性炭用量4.0%、pH1.5、脱色时间1.0 h；在此条件下，脱色率达到82.19%±0.20%，蛋白保留率为90.93%±2.28%。采用优化工艺对南极磷虾蛋白肽进行脱色处理，样品氨基酸组成中必需氨基酸与非必需氨基酸的占比以及样品的分子量分布不会发生明显变化。研究将为优质南极磷虾蛋白肽产品开发提供支撑。Abstract: In order to optimize the decolorization process of Antarctic krill peptides and improve the product quality, activated carbon adsorption method was used to remove the pigment from the Antarctic krill peptides solution. Taking the decolorization rate and protein retention rate as the evaluation indexes, the influence of four independent variables including dosage of activated carbon, pH, decolorization temperature and decolorization time on the decolorization effect were investigated respectively. On the basis of single factor experiment, three independent variables including dosage of activated carbon, pH and decolorization time were optimized by the response surface methodology under the decolorization temperature of 50 ℃. Results showed that powdered activated carbon was more suitable for the removal of pigment from Antarctic krill peptides when compared with granular activated carbon, and the optimal conditions determined by response surface methodology were as follows: dosage of activated carbon 4.0%, pH1.5 and decolorization time 1.0 h. Under the optimal conditions, the decolorization rate was 82.19%±0.20% and the protein retention rate was 90.93%±2.28%. The decolorization treatment had no obvious effects on the proportion of essential amino acids and nonessential amino acids in the amino acid compositions as well as the molecular weight distribution of Antarctic krill peptides. This research would provide scientific support for the development of high-quality Antarctic krill peptides products.
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Keywords:
- Antarctic krill /
- peptides /
- decolorization /
- activated carbon /
- response surface methodology
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南极磷虾（Euphausia superba）是南大洋海洋浮游动物中一个重要类群，生物量约达6.5~10亿吨，是目前资源极其丰富而开发利用程度很低的单种可捕生物资源[1-2]。南极磷虾含有丰富的蛋白质[3-4]，被认为是地球上最大的动物性蛋白资源库[5-6]。近年来相关研究证明，南极磷虾蛋白肽具有良好的生理活性，包括抗氧化[7-8]、改善骨质疏松[9-10]、降血压[11]、缓解疲劳[12]、调节血糖[13]、改善皮肤光老化[14]等。鉴于其丰富的资源量和良好的营养功能，南极磷虾蛋白肽的生产开发引起行业关注。目前关于南极磷虾蛋白肽制备的研究集中在酶解工艺优化方面，主要涉及最适酶的筛选、酶解条件优化等[15-17]。然而在酶解过程中，水溶性色素也会被同时提取，导致获得的南极磷虾蛋白肽呈棕黄色甚至褐色，引起感官不适，限制产品的后续开发和深度应用。因此，针对酶解获得的南极磷虾蛋白肽进行脱色处理十分必要，但目前尚未见相关研究报道。
海洋动物蛋白及其水解物的脱色处理主要采用化学法和物理法。化学脱色法由于需要引入氧化型或还原型化学试剂，易引起脱色液中各组分理化性质的改变，且存在一定程度的安全隐患；物理脱色法主要通过吸附作用达到效果，对脱色液的性质影响较小，安全性更高[18]。活性炭吸附法是工业化生产中常用的物理脱色法，具有吸附效果好、对样品影响小、成本低廉、操作简便等优点，目前已在鱿鱼皮胶原蛋白[18]、鳕鱼皮胶原蛋白肽[19]、鲟鱼皮胶原蛋白肽[20]、鳕鱼肉酶解液[21]、鱼籽多肽[22]等海洋动物蛋白及其水解物的脱色处理中得到良好应用。综上，本研究采用活性炭吸附法对南极磷虾蛋白肽进行脱色处理，研究活性炭类型对脱色效果的影响，通过单因素实验和响应面试验对活性炭用量、pH、脱色温度、脱色时间等工艺条件进行优化，旨在为优质南极磷虾蛋白肽产品开发提供支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
脱脂南极磷虾粉 青岛南极维康生物科技有限公司；碱性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，200000 U/mL） 丹麦诺维信生物技术有限公司；粉末活性炭、颗粒活性炭 国药集团化学试剂有限公司；Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；盐酸 分析纯，西陇科学股份有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
SHA-B型恒温振荡器、HH-4型数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；ST3100型pH计 奥豪斯仪器（常州）有限公司；LXJ-IIB型离心机 上海安亭科学仪器厂；Neofuge 15R型高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；CTFD-10P型冷冻干燥机 青岛永合创信电子科技有限公司；UV1-102II型紫外/可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪 日立科学仪器（北京）有限公司；LC-20AD型液相色谱仪 日本岛津株式会社；BSA224S-CW型电子分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 南极磷虾蛋白肽脱色处理工艺
采用碱性蛋白酶酶解制备南极磷虾蛋白肽[16,23]：称取适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6 （g/mL）添加pH7.5的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，混匀，根据脱脂南极磷虾粉质量加入2% （v/m）的碱性蛋白酶，55 ℃酶解4 h后于95 ℃加热灭酶20 min，冷却至室温，5000 r/min离心20 min，收集上清液，即得南极磷虾蛋白肽溶液。获得的南极磷虾蛋白肽溶液在相应实验条件下进行脱色处理后，冷却至室温，8000 r/min离心15 min，收集上清液，测定相关评价指标。
1.2.2 活性炭类型的筛选
参考文献方法对比研究不同类型活性炭在南极磷虾蛋白肽脱色处理中的效果差异[18,22,24-25]。在溶液pH2.0、4.0、6.0条件下，分别添加2.0% （m/v）、5.0% （m/v）、10.0% （m/v）的粉末活性炭或颗粒活性炭，50 ℃水浴振荡脱色处理1.0 h，冷却至室温，8000 r/min离心15 min，收集上清液，以脱色率为评价指标，确定适宜采用的活性炭类型。
1.2.3 单因素实验
进行活性炭用量、pH、脱色温度、脱色时间的单因素优化：固定pH6.0、脱色温度50 ℃，脱色时间1.0 h，考察活性炭用量0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0% （m/v）对脱色效果的影响；固定活性炭用量2.0% （m/v）、脱色温度50 ℃、脱色时间1.0 h，考察pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0对脱色效果的影响；固定活性炭用量2.0% （m/v）、pH6.0、脱色时间1.0 h，考察脱色温度30、40、50、60、70 ℃对脱色效果的影响；固定活性炭用量2.0% （m/v）、pH6.0、脱色温度50 ℃，考察脱色时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h对脱色效果的影响；以脱色率和蛋白保留率为评价指标，确定各单因素的最佳条件。
1.2.4 响应面试验
根据单因素实验结果，采用Box-Behnken实验设计方法对活性炭用量、pH、脱色时间进行三因素三水平设计，见表1。以脱色率为响应值，采用Design Expert V8.0.6对实验数据进行回归分析，确定最佳脱色工艺条件。
表 1 Box-Behnken实验设计因素水平Table 1. Experimental factor levels in the Box-Behnken design因素 水平 −1 0 1 A 活性炭用量（%） 2.0 3.0 4.0 B pH 1.0 2.0 3.0 C 脱色时间（h） 0.5 1.0 1.5 1.2.5 脱色率的测定
将南极磷虾蛋白肽溶液在380~700 nm光谱范围内进行全波长扫描，确定多肽溶液中色素的特征吸收波长。在特定吸收波长下测定多肽溶液脱色前后吸光值，并按照以下公式计算脱色率[20,22]：
脱色率（%）=（脱色前溶液吸光值−脱色后溶液吸光值）/脱色前溶液吸光值×100
1.2.6 蛋白保留率的测定
按试剂盒说明书的规定测定脱色处理前后溶液中的蛋白含量。蛋白保留率按照以下公式计算[20,22]：
蛋白保留率（%）=脱色后溶液中蛋白含量/脱色前溶液中蛋白含量×100
1.2.7 脱色处理前后南极磷虾蛋白肽的组成分析
按照响应面试验确定的最优工艺条件对南极磷虾蛋白肽溶液进行脱色处理，处理前后的蛋白肽溶液分别经真空冷冻干燥后进行组成分析：蛋白质含量按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的规定执行；灰分含量按照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》的规定执行；盐分含量按照SC/T 3011-2001《水产品中盐分的测定》的规定执行；水分含量按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》的规定执行；氨基酸组成按照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》的规定执行；分子量分布按照GB 31645-2018《食品安全国家标准 胶原蛋白肽》中附录A的规定执行。
1.3 数据处理
实验数据采用“平均值±标准偏差”的形式表示，采用IBM SPSS 20.0、Excel 2016、Origin 2018、Design Expert V8.0.6等软件进行数据处理和图表绘制。采用独立样品t检验进行两两比较，采用单因素方差分析进行组间多重比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 南极磷虾蛋白肽溶液色素特征吸收波长
南极磷虾蛋白肽溶液在380~700 nm波长范围内的吸收光谱见图1。结果显示，溶液在400 nm波长处具有明显的吸收峰，因此，确定南极磷虾蛋白肽溶液中色素的特征吸收波长为400 nm。
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图 1 南极磷虾蛋白肽溶液的可见吸光光谱Figure 1. The absorption spectrum of the Antarctic krill peptides solution2.2 活性炭类型的筛选确定
不同类型活性炭对南极磷虾蛋白肽脱色效果的影响见表2。结果显示，粉末活性炭和颗粒活性炭都能达到一定的脱色效果，但在相同的活性炭用量和pH条件下，粉末活性炭的脱色效果均极显著优于颗粒活性炭（P<0.01），推测这跟粉末活性炭与色素接触时的比表面积更大、不易达到吸附平衡有关，该研究结果与已有报道保持一致[18,24,26]。因此，确定粉末活性炭为本研究中最适宜采用的吸附剂。
表 2 不同类型活性炭对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响Table 2. Effect of different types of activated carbon on decolorization rate of Antarctic krill peptidespH 活性炭用量（%） 脱色率（%） 粉末活性炭 颗粒活性炭 2.0 2.0 67.21±0.38 16.49±1.60** 5.0 91.04±0.58 21.63±0.77** 10.0 99.97±0.01 19.12±0.36** 4.0 2.0 46.30±1.40 26.74±0.71** 5.0 59.88±1.71 27.85±0.06** 10.0 90.42±0.10 27.29±0.45** 6.0 2.0 41.97±0.68 16.29±0.73** 5.0 55.89±0.75 13.84±0.27** 10.0 79.05±1.87 13.17±0.48** 注：**表示在相同工艺条件下与粉末活性炭处理组相比差异极显著（P<0.01）。 2.3 单因素实验结果
活性炭用量对南极磷虾蛋白肽脱色效果的影响见图2。活性炭用量在0.5%~5.0%范围时，脱色率随着活性炭用量的增加而逐渐升高，活性炭用量对样品脱色效果影响显著（P<0.05）。各实验组的蛋白保留率随着活性炭用量的增加而逐渐降低，当活性炭用量在0.5%~3.0%范围时，蛋白保留率均在90%以上；当活性炭用量增加至5.0%时，蛋白保留率下降至83.91%±1.38%。这可能是因为粉末活性炭具有多孔结构，可以有效吸附色素分子，适当地增加活性炭用量，能够有效提高脱色效果[18,22,27]，但当活性炭用量过大时，被吸附损失的蛋白肽也会显著增多，导致蛋白保留率明显降低[20,24,27]。因此，确定活性炭用量3.0%为最佳实验条件。
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pH对南极磷虾蛋白肽脱色效果的影响见图3。pH在1.0~2.0范围时，脱色率随着pH的增加而有所提高；当pH为2.0时，脱色率达到最高；而后随着pH的增加，脱色率不断下降；pH对样品脱色效果影响显著（P<0.05）。粉末活性炭在酸性条件下呈现更强的吸附色素能力，这是因为活性炭吸附色素的过程需要H+的参与，适当提高样品中H+的浓度，可以提高脱色率，这与已有的研究报道结果一致[18-22,25,27-28]。在pH1.0~6.0范围内进行脱色处理，各实验组的蛋白保留率均在90%以上，无显著差异（P>0.05）。因此，确定pH2.0为最佳实验条件。
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图 3 pH对脱色率和蛋白保留率的影响Figure 3. Influence of pH on decolorization rate and protein retention rate脱色温度对南极磷虾蛋白肽脱色效果的影响见图4。脱色温度在30~50 ℃范围时，脱色率随着脱色温度的升高而有所提高；脱色温度在50~60 ℃范围时，脱色率增幅较小，趋于稳定；当脱色温度大于60 ℃后，脱色率则出现下降。在一定温度范围内，脱色温度的升高可使样品体系中的热运动加剧，增加了活性炭和色素分子间的碰撞结合机率，脱色效果得到提高；当脱色温度继续升高时，活性炭与色素分子间的吸附和解析达到平衡，脱色效果趋于稳定；但当脱色温度超过一定值后，活性炭与色素分子的解析机率明显增加，脱色效果出现下降[20,22,29-30]。在30~70 ℃温度范围内进行脱色处理，各实验组的蛋白保留率均在90%以上，无显著差异（P>0.05）。考虑到酶解时采用的处理温度为55 ℃，在实际生产中酶解和脱色工艺切换时料液会有小幅度的降温，而再次加热或冷却料液会增加生产成本，因此确定脱色温度50 ℃为最佳实验条件，在响应面优化时也将脱色温度固定为50 ℃不再作进一步考察。
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图 4 脱色温度对脱色率和蛋白保留率的影响Figure 4. Influence of decolorization temperature on decolorization rate and protein retention rate脱色时间对南极磷虾蛋白肽脱色效果的影响见图5。在0.5~1.0 h的脱色时间范围时，随着时间增加，脱色率不断提高；当脱色时间为1.0 h时，脱色率达到最高；而后随着脱色时间的延长，脱色率有所下降。延长脱色时间，有助于活性炭与色素分子的充分接触，从而提高吸附效果；但处理时间过长，也增加了活性炭与色素分子解析的机率，脱色效果降低[19,22,28]。在0.5~1.5 h时间范围内进行脱色处理，各实验组的蛋白保留率均在90%以上，无显著差异（P>0.05）；而后随着脱色时间的延长，蛋白保留率不断降低。综合考虑脱色效果和蛋白保留率，确定脱色时间1.0 h为最佳实验条件。
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图 5 脱色时间对脱色率和蛋白保留率的影响Figure 5. Influence of decolorization time on decolorization rate and protein retention rate2.4 响应面试验结果
根据单因素实验结果，固定脱色温度50 ℃，依据Box-Behnken实验设计原理，对活性炭用量（A）、pH（B）、脱色时间（C）进行三因素三水平响应面优化，实验结果见表3。对响应面实验数据进行二次多元回归拟合，得到脱色率（Y）与自变量A、B、C的回归方程为：Y=77.45+9.24A−3.66B+0.13C+0.34AB+0.79AC+0.32BC−1.89A2−2.80B2−1.88C2。
表 3 Box-Behnken实验设计与结果Table 3. Box-Behnken experimental design and result编号 A B C Y 脱色率（%） 1 1 0 −1 82.35 2 0 0 0 78.76 3 0 0 0 77.09 4 −1 0 1 63.45 5 0 0 0 77.24 6 1 −1 0 85.50 7 0 −1 −1 76.12 8 0 1 1 70.08 9 0 0 0 76.99 10 −1 0 −1 65.02 11 −1 1 0 59.34 12 1 1 0 78.09 13 −1 −1 0 68.13 14 1 0 1 83.93 15 0 −1 1 75.98 16 0 1 −1 68.93 17 0 0 0 77.19 对模型拟合结果进行方差分析，结果见表4。由表4可知，模型项P<0.0001，表明该回归模型极显著，失拟项P=0.4656>0.05，表明失拟项不显著，说明该模型与数据拟合程度较高。在本实验中，A、B、A2、B2、C2对脱色率影响极显著（P<0.01），C与交互项对脱色率影响不显著（P>0.05）。由F值可知，各因素对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响程度为：A>B>C，即活性炭用量>pH>脱色时间。此外，该回归模型的R2=0.9956，且R2Adj=0.9898，表明该模型拟合度和可信度均较高。以上分析表明，该模型可应用于南极磷虾蛋白肽脱色条件的分析和预测。
表 4 回归模型方差分析Table 4. Variance analysis of regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 模型 863.81 9 95.98 174.06 <0.0001** A 683.21 1 683.21 1238.99 <0.0001** B 107.24 1 107.24 194.48 <0.0001** C 0.13 1 0.13 0.24 0.6421 AB 0.48 1 0.48 0.86 0.3837 AC 2.48 1 2.48 4.50 0.0716 BC 0.42 1 0.42 0.75 0.4139 A² 15.03 1 15.03 27.26 0.0012** B² 33.00 1 33.00 59.84 0.0001** C² 14.83 1 14.83 26.90 0.0013** 残差 3.86 7 0.55 失拟项 1.69 3 0.56 1.04 0.4656 误差值 2.17 4 0.54 总离差 867.67 16 注：**表示差异极显著（P<0.01）。 活性炭用量、pH、脱色时间3个因素之间交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响见图6、图7和图8。活性炭用量与pH、活性炭用量与脱色时间、pH与脱色时间两两之间的交互作用对脱色率影响均不显著，这与方差分析结果一致。响应面图中曲面的变化幅度可直接反映各因素对响应值的影响程度[17]，由图6、图7可知，随着活性炭用量的增加，脱色率逐渐增加，增幅明显；由图6、图8可知，随着pH的增加，脱色率呈先增加后减小趋势，变化幅度较小；由图7、图8可知，随着脱色时间的增加，脱色率呈先增加后减小趋势，变化幅度较小；综上可知，活性炭用量对脱色率的影响程度要大于pH和脱色时间，这也与方差分析结果一致。
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图 6 活性炭用量与pH的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响Figure 6. Interaction effect of dosage of activated carbon and pH on decolorization rate of Antarctic krill peptides![]()
图 7 活性炭用量与脱色时间的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响Figure 7. Interaction effect of dosage of activated carbon and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides![]()
图 8 pH与脱色时间的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响Figure 8. Interaction effect of pH and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides经Design Expert V8.0.6软件分析得到南极磷虾蛋白肽脱色的最佳条件为：活性炭用量4.0%、pH1.42、脱色时间1.1 h，在此条件下模型预测的脱色率为85.86%。为方便实际操作，将最佳脱色条件调整为：活性炭用量4.0%、pH1.5、脱色时间1.0 h，在此条件下进行三次验证实验，脱色率为82.19%±0.20%，与理论值接近，证明该模型可靠。同时，在最佳脱色工艺条件下，蛋白保留率为90.93%±2.28%，表明优化后的工艺可行。
2.5 脱色前后南极磷虾蛋白肽的组成分析
脱色处理前后南极磷虾蛋白肽的组成分析结果见表5、表6。脱色处理后样品的蛋白质含量由80.57%±0.40%降低至71.18%±0.19%（P<0.01），而盐分、灰分含量极显著提高（P<0.01），这可能与脱色处理导致的蛋白损失、调节最佳工艺条件时酸碱的引入以及脱色吸附剂残留等原因有关。脱色处理前后南极磷虾蛋白肽的必需氨基酸含量分别占总氨基酸含量的39.29%±0.12%和39.41%±0.34%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为64.72%±0.34%和65.05%±0.92%；脱色处理前后南极磷虾蛋白肽的分子量均主要分布在189~6500 Da范围，占比分别为86.06%±1.16%和86.79%±1.19%；综上可知，采用优化工艺对南极磷虾蛋白肽进行脱色处理，样品氨基酸组成中必需氨基酸与非必需氨基酸的占比以及样品的分子量分布均未发生显著变化（P>0.05）。脱色后获得的南极磷虾蛋白肽，氨基酸组成基本符合联合国粮农组织/世界卫生组织规定的优质蛋白标准（必需氨基酸占氨基酸总量的40%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%），分子量分布符合生物活性肽分子量分布范围[31]，具有良好的营养价值。需要关注的是，脱色后获得的南极磷虾蛋白肽，色泽得到改善，但仍存在盐分含量较高的问题，这不仅会影响蛋白肽的口感和功能，也会给消费者健康带来一定的潜在风险[23,32]，如何去除样品中过量的盐分应进一步研究。
表 5 脱色前后南极磷虾蛋白肽的组成Table 5. The compositions of Antarctic krill peptides before and after decolorization检测指标（g/100 g） 脱色前 脱色后 基本组成 蛋白质 80.57±0.40 71.18±0.19** 灰分 10.68±0.10 15.12±0.09** 盐分 8.74±0.10 10.90±0.10** 水分 4.64±0.13 5.49±0.15** 氨基酸组成 天冬氨酸 Asp 9.23±0.07 8.02±0.09** 苏氨酸a Thr 3.66±0.04 3.23±0.06** 丝氨酸 Ser 3.49±0.10 3.03±0.14** 谷氨酸 Glu 12.33±0.15 10.93±0.15** 甘氨酸 Gly 4.38±0.04 3.76±0.05** 丙氨酸 Ala 5.15±0.03 4.57±0.07** 缬氨酸a Val 4.28±0.11 3.86±0.14* 甲硫氨酸a Met 2.46±0.02 2.24±0.04** 异亮氨酸a Ile 3.77±0.11 3.29±0.15* 亮氨酸a Leu 6.57±0.04 5.71±0.09** 酪氨酸 Tyr 3.50±0.06 2.89±0.01** 苯丙氨酸a Phe 3.79±0.04 3.14±0.07** 赖氨酸a Lys 6.50±0.05 5.88±0.08** 组氨酸 His 1.90±0.01 1.72±0.04** 精氨酸 Arg 4.44±0.03 3.97±0.07** 脯氨酸 Pro 3.51±0.06 3.11±0.10** 氨基酸总量（Total amino acids, TAA） 78.97±0.57 69.37±0.96** 必需氨基酸（Essential amino acids, EAA） 31.03±0.30 27.34±0.52** 非必需氨基酸（Nonessential amino acids, NEAA） 47.94±0.29 42.03±0.53** EAA/TAA（%） 39.29±0.12 39.41±0.34 EAA/NEAA（%） 64.72±0.34 65.05±0.92 注：a表示必需氨基酸；*表示与脱色前相比差异显著（P<0.05）；**表示与脱色前相比差异极显著（P<0.01）。 表 6 脱色前后南极磷虾蛋白肽的分子量分布Table 6. The molecular weight distribution of Antarctic krill peptides before and after decolorization分子量（Da） 脱色前 脱色后 >12500 0.07±0.02 0.04±0.04 12500~6500 0.72±0.12 0.56±0.10 6500~1450 16.41±0.27 16.86±0.29 1450~451 32.82±0.23 33.95±0.67 451~189 36.83±1.02 35.99±1.62 <189 13.16±1.11 12.61±1.22 3. 结论
活性炭吸附法能够有效实现南极磷虾蛋白肽中色素的脱除，粉末活性炭的脱色效果优于颗粒活性炭；当脱色温度为50 ℃时，经响应面优化得到最佳脱色工艺条件为：活性炭用量4.0%、pH1.5、脱色时间1.0 h；在此条件下，脱色率达到82.19%±0.20%。采用优化工艺脱色处理后，样品氨基酸组成中必需氨基酸与非必需氨基酸的占比以及样品的分子量分布均无明显变化。考虑到脱色后获得的南极磷虾蛋白肽盐分含量较高，后续研究需关注样品的脱盐处理，以进一步提升产品品质。本研究对于南极磷虾蛋白产品开发和规模化生产具有重要参考价值。
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图 1 南极磷虾蛋白肽溶液的可见吸光光谱
Figure 1. The absorption spectrum of the Antarctic krill peptides solution
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图 3 pH对脱色率和蛋白保留率的影响
Figure 3. Influence of pH on decolorization rate and protein retention rate
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图 4 脱色温度对脱色率和蛋白保留率的影响
Figure 4. Influence of decolorization temperature on decolorization rate and protein retention rate
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图 5 脱色时间对脱色率和蛋白保留率的影响
Figure 5. Influence of decolorization time on decolorization rate and protein retention rate
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图 6 活性炭用量与pH的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响
Figure 6. Interaction effect of dosage of activated carbon and pH on decolorization rate of Antarctic krill peptides
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图 7 活性炭用量与脱色时间的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响
Figure 7. Interaction effect of dosage of activated carbon and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides
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图 8 pH与脱色时间的交互作用对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响
Figure 8. Interaction effect of pH and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides
表 1 Box-Behnken实验设计因素水平
Table 1 Experimental factor levels in the Box-Behnken design
因素 水平 −1 0 1 A 活性炭用量（%） 2.0 3.0 4.0 B pH 1.0 2.0 3.0 C 脱色时间（h） 0.5 1.0 1.5 
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表 2 不同类型活性炭对南极磷虾蛋白肽脱色率的影响
Table 2 Effect of different types of activated carbon on decolorization rate of Antarctic krill peptides
pH 活性炭用量（%） 脱色率（%） 粉末活性炭 颗粒活性炭 2.0 2.0 67.21±0.38 16.49±1.60** 5.0 91.04±0.58 21.63±0.77** 10.0 99.97±0.01 19.12±0.36** 4.0 2.0 46.30±1.40 26.74±0.71** 5.0 59.88±1.71 27.85±0.06** 10.0 90.42±0.10 27.29±0.45** 6.0 2.0 41.97±0.68 16.29±0.73** 5.0 55.89±0.75 13.84±0.27** 10.0 79.05±1.87 13.17±0.48** 注：**表示在相同工艺条件下与粉末活性炭处理组相比差异极显著（P<0.01）。
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表 3 Box-Behnken实验设计与结果
Table 3 Box-Behnken experimental design and result
编号 A B C Y 脱色率（%） 1 1 0 −1 82.35 2 0 0 0 78.76 3 0 0 0 77.09 4 −1 0 1 63.45 5 0 0 0 77.24 6 1 −1 0 85.50 7 0 −1 −1 76.12 8 0 1 1 70.08 9 0 0 0 76.99 10 −1 0 −1 65.02 11 −1 1 0 59.34 12 1 1 0 78.09 13 −1 −1 0 68.13 14 1 0 1 83.93 15 0 −1 1 75.98 16 0 1 −1 68.93 17 0 0 0 77.19
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表 4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 模型 863.81 9 95.98 174.06 <0.0001** A 683.21 1 683.21 1238.99 <0.0001** B 107.24 1 107.24 194.48 <0.0001** C 0.13 1 0.13 0.24 0.6421 AB 0.48 1 0.48 0.86 0.3837 AC 2.48 1 2.48 4.50 0.0716 BC 0.42 1 0.42 0.75 0.4139 A² 15.03 1 15.03 27.26 0.0012** B² 33.00 1 33.00 59.84 0.0001** C² 14.83 1 14.83 26.90 0.0013** 残差 3.86 7 0.55 失拟项 1.69 3 0.56 1.04 0.4656 误差值 2.17 4 0.54 总离差 867.67 16 注：**表示差异极显著（P<0.01）。
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表 5 脱色前后南极磷虾蛋白肽的组成
Table 5 The compositions of Antarctic krill peptides before and after decolorization
检测指标（g/100 g） 脱色前 脱色后 基本组成 蛋白质 80.57±0.40 71.18±0.19** 灰分 10.68±0.10 15.12±0.09** 盐分 8.74±0.10 10.90±0.10** 水分 4.64±0.13 5.49±0.15** 氨基酸组成 天冬氨酸 Asp 9.23±0.07 8.02±0.09** 苏氨酸a Thr 3.66±0.04 3.23±0.06** 丝氨酸 Ser 3.49±0.10 3.03±0.14** 谷氨酸 Glu 12.33±0.15 10.93±0.15** 甘氨酸 Gly 4.38±0.04 3.76±0.05** 丙氨酸 Ala 5.15±0.03 4.57±0.07** 缬氨酸a Val 4.28±0.11 3.86±0.14* 甲硫氨酸a Met 2.46±0.02 2.24±0.04** 异亮氨酸a Ile 3.77±0.11 3.29±0.15* 亮氨酸a Leu 6.57±0.04 5.71±0.09** 酪氨酸 Tyr 3.50±0.06 2.89±0.01** 苯丙氨酸a Phe 3.79±0.04 3.14±0.07** 赖氨酸a Lys 6.50±0.05 5.88±0.08** 组氨酸 His 1.90±0.01 1.72±0.04** 精氨酸 Arg 4.44±0.03 3.97±0.07** 脯氨酸 Pro 3.51±0.06 3.11±0.10** 氨基酸总量（Total amino acids, TAA） 78.97±0.57 69.37±0.96** 必需氨基酸（Essential amino acids, EAA） 31.03±0.30 27.34±0.52** 非必需氨基酸（Nonessential amino acids, NEAA） 47.94±0.29 42.03±0.53** EAA/TAA（%） 39.29±0.12 39.41±0.34 EAA/NEAA（%） 64.72±0.34 65.05±0.92 注：a表示必需氨基酸；*表示与脱色前相比差异显著（P<0.05）；**表示与脱色前相比差异极显著（P<0.01）。
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表 6 脱色前后南极磷虾蛋白肽的分子量分布
Table 6 The molecular weight distribution of Antarctic krill peptides before and after decolorization
分子量（Da） 脱色前 脱色后 >12500 0.07±0.02 0.04±0.04 12500~6500 0.72±0.12 0.56±0.10 6500~1450 16.41±0.27 16.86±0.29 1450~451 32.82±0.23 33.95±0.67 451~189 36.83±1.02 35.99±1.62 <189 13.16±1.11 12.61±1.22
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