Effect of Different Fermentation Methods on the Quality and Flavor of Semen Sojae Preparatum
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摘要: 为提高根霉发酵淡豆豉（Semen Sojae Preparatum，SSP）品质及风味，本研究采用中国根霉12和乳酸芽孢杆菌DU-106复合发酵淡豆豉，对比了纯根霉发酵与混菌发酵淡豆豉发酵过程中基本理化指标及生物活性物质、游离氨基酸、挥发性成分的变化。结果表明两种发酵方式对基本成分的影响变化不大，而混菌发酵淡豆豉溶栓酶活性（3927.84 IU/g）高于根霉发酵淡豆豉（2152.20 IU/g），大豆异黄酮含量（3.91 mg/g）高于根霉发酵淡豆豉（3.20 mg/g）。混菌发酵后淡豆豉苦味氨基酸及鲜味氨基酸轻微降低，两种发酵模式风味物质种类相近但数量发生变化，根霉发酵吡嗪类风味物质最多，混菌发酵烷烃类风味物质最多，电子鼻结果表明混菌发酵和根霉发酵风味差别显著。因此，混菌发酵在提高根霉发酵淡豆豉溶栓酶活性、游离氨基酸含量及改善风味等方面具有积极作用。Abstract: In present study, Rhizopus chinensis 12 mixed fermentation with Bacillus sp. DU-106 were performed to improve the quality and flavor of Semen Sojae Praeparatum (SSP). The levels of physicochemical characteristics, bioactive compounds, free amino acids, and volatile components during the mixed fermentation process were monitored. Compared to SSP fermented only with R. chinensis 12, the levels of physicochemical characteristics were not obviously changed after mixed fermentation. However, thrombolytic enzyme activity and soy isoflavone content after mixed fermentation were significantly higher when compared to those of SSP fermented only with R. chinensis 12, and reached to 3927.84 IU/g and 3.91 mg/g, respectively. The amount of bitter amino acids and umami amino acids after mixed fermentation slightly lower than those of SSP fermented only with R. chinensis 12. The contents of flavor composition were considerably altered after mixed fermentation, of which, the pyrazine prevailed in SSP fermented only with R. chinensis 12, while, alkane predominated in SSP after mixed fermentation. Overall, the Rhizopus chinensis 12 mixed fermentation with Bacillus sp. DU-106 contributed to improve the thrombolytic activity, free amino acid content, and flavors of SSP.
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淡豆豉是以黑豆为原料经发酵而得的具有药食同源性质的食品，具有降血脂、抗抑郁的功效，与纳豆（黄豆发酵）具有相似的生理功能[1]，但发酵所用原料及菌株不同。黑豆的蛋白质含量高达36%～40%，同时含有丰富的黄酮类成分，如异黄酮、花色素、黄酮醇、双黄酮、查耳酮、二氢黄酮等活性成分[2]，经发酵后其活性物质的含量及构成发生改变。此外，淡豆豉具有一定的溶栓酶活性，该酶有益于减少血栓的形成[3]。
近年来，国内对于淡豆豉的研究主要集中在纯种制曲、双菌种制曲[4]、后发酵工艺探究及低盐豆豉的研究等方面。李响等[4]利用毛霉和枯草芽孢杆菌发酵豆豉表明混菌发酵可有效提高大豆发酵制品的品质特性，证实使用细菌和霉菌混合发酵可有效改善大豆发酵食品的品质特性。李俊健等[5]通过多菌复合毕赤酵母发酵优化淡豆豉的发酵工艺条件，提高了淡豆豉溶栓酶活性，但缺乏对风味和基本成分的研究。众所周知，植物乳杆菌能够产生丰富的风味物质，能够改善食品风味，如崔宪等[6]以植物乳杆菌发酵大豆分离蛋白，结果表明植物乳杆菌发酵有助于大豆分离蛋白的水解，因此，采用植物乳杆菌复合发酵淡豆豉有助于大豆蛋白的水解利用及风味物质的产生。文鹤等[7]对比了纯种产香酵母Trichomonascus ciferrii发酵豆豉与自然发酵豆豉的挥发性成分，自然发酵中检测出87种挥发性成分，纯种发酵中检测出44种成分，相较于纯种发酵，自然发酵豆豉其风味更加的多元及稳定。由于不同地理气候、温度、湿度等自然条件原因，自然发酵难以精确控制，难以实现工业生产，混菌发酵模拟了自然发酵多菌株共同发酵的特点，有助于提升风味物质丰度及降低控制难度，是改善淡豆豉风味实现工业生产的重要途径。然而，对于混菌发酵改善淡豆豉风味及相关产生机制的研究缺乏深入的探索，严重限制了淡豆豉的推广应用。在本团队前期的研究中，以中国根霉12为发酵菌株发酵淡豆豉，并对比了黑龙江、云南、福建、内蒙古、河南五个地区黑豆根霉发酵淡豆豉的理化指标及风味指标，数据表明黑龙江黑豆根霉发酵所得的淡豆豉风味与品质明显优于其他地区发酵淡豆豉。在最优工艺下得到的淡豆豉溶栓酶活力为17122 U/g[8]，但其发酵过程中营养成分和挥发性物质的变化还有待进一步研究。
鉴于此，本研究以黑龙江黑豆为原料，采用根霉发酵和混菌发酵两种发酵方式，动态对比两种发酵模式中淡豆豉基本成分、活性成分及风味的变化。为淡豆豉的发酵机理、发酵过程中风味成分和活性成分变化的规律及形成机制提供了参考价值。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑龙江黑豆 十月稻田农业科技有限公司；凝血酶1000 IU 美国Sigma公司；纤维蛋白原及尿激酶1240 IU 中检所；大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆素、黄豆黄素、染料木素等标准品 HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；中国根霉12、乳酸芽孢杆菌DU-106与植物乳杆菌混合菌粉 保藏于华南农业大学食品学院新资源食品与功能性原料研究及评价中心；磷酸缓冲盐溶液（PBS） 实验室配制；5%磺基水杨酸溶液 广州成硕生物科技有限公司。
GCMS-QP2010ULTRA气相色谱-质谱仪、LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；雷磁PHS-3E pH计 上海仪电公司；日立L-8900型氨基酸分析仪 日立高新技术公司；FD-1真空冷冻干燥机 北京博医康技术公司；Rapid N exceed杜马斯定氮仪 上海艾力蒙塔贸易有限公司；PEN3电子鼻 北京盈盛恒泰科技有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 淡豆豉发酵工艺
参考文献[9]的方法并略作修改，发酵工艺（图1）操作要点如下：5倍体积三级水25 ℃避光浸泡12 h；20 ℃湿度90%避光发芽48 h；121 ℃灭菌15 min；冷却至35 ℃以下接种；根霉发酵接种孢子数为2×107～5×107个/mL根霉活化液2%（V/W），混菌发酵须添加107 CFU/mL乳酸菌活化液2%（V/W）和孢子数为2×107～5×107个/mL根霉活化液2%（V/W），32 ℃避光发酵9 d[10]。
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图 1 不同发酵方式对pH、总酸和菌落总数变化对比Figure 1. Comparison of different fermentation methods on pH, total acid and total number of bacteria取样方法：分别取发酵0、1、3、5、7、9 d的淡豆豉冻干粉碎过80目筛样品进行分析。
1.2.2 淡豆豉基本成分测定
pH测定：称取5.00 g样品粉末，加入25 mL蒸馏水，振荡20 min，使用pH计直接测定。
菌落总数：参照GB 4789.2-2016[11]；总糖和还原糖：采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定总糖和还原糖[12]；总酸：参照GB 12456-2021[13]；蛋白质：采用杜马斯燃烧法测定蛋白质[14]；脂肪：参照GB 5009.6-2016[15]；灰分：参照GB 5009.4-2016[16]；氨基酸态氮：参照GB 5009.235-2016[17]。
1.2.3 淡豆豉活性成分测定
1.2.3.1 溶栓酶测定
参考文献[18]的方法测定淡豆豉溶栓酶活性。
PBS溶液的配制：称取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63 g，KH2PO4 0.24 g，溶于900 mL蒸馏水中，用盐酸调pH至7.4，用蒸馏水定容至1 L，常温保存。
取0.05 g淡豆豉样品溶于1.5 mL PBS溶液，4 ℃静置24 h，摇匀，10000 r/min离心10 min，取上清液备用。将10 μL样品溶液打入纤维蛋白琼脂糖平板的圆孔内，37 ℃培养18 h后，分别测定纤维蛋白溶解圈的两个垂直直径，计算其乘积近似为纤维蛋白溶解圈的面积。将待测样品的透明圈面积与标准曲线比较，计算样品酶活大小。
1.2.3.2 γ-氨基丁酸测定
采用比色法测定γ-氨基丁酸[19]。
标准溶液及曲线制备：准确称量γ-氨基丁酸标品100 mg，一级水定容至100 mL，稀释得到0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL标准溶液，取标准溶液0.5 mL，加入0.5 mL的硼酸盐缓冲溶液（pH9.0，0.2 mol/L）、1 mL 6%的重蒸苯酚，摇匀，3 min后加入1 mL NaClO溶液（活性氯为8%~12%），混匀后沸水浴10 min，取出立即冰浴20 min，持续震荡直至出现蓝绿色化合物，加入60%的乙醇溶液2.0 mL，再次震荡均匀，静置10 min后于645 nm处测定吸光度，以蒸馏水代替标准液做空白对照。
样品γ-氨基丁酸提取及测定：准确称量0.50 g豆豉粉末以蒸馏水定容至50 mL，60 ℃水浴震荡2 h，4000 r/min离心20 min，取上清经0.45 μm微膜过滤，取0.5 mL按标曲方法步骤测定，曲线公式为：Y=1.9633X+0.0231（R2=0.9992）。
1.2.3.3 大豆异黄酮测定
参考文献[20]方法及其洗脱程序，采用高效液相色谱法测定大豆异黄酮，通过保留值定性分析大豆异黄酮，通过外标标准曲线法以峰面积为指标定量分析大豆异黄酮含量。色谱柱为Agela promosil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温36 ℃；进样量10 μL；流动相为0.1%（V/V）乙酸水溶液（A）和100%乙腈（B）；流速为1 mL/min；检测波长260 nm（UV）。
1.2.4 淡豆豉风味成分测定
1.2.4.1 豆豉游离氨基酸含量测定
样品前处理：0.1 g样品用3 mL 5%磺基水杨酸溶液研磨，转移到离心管，静置1 h，12000 r/min离心10 min，取上清液按1:3 比例和水稀释，并通过0.22 μm滤膜装置将混合液过滤在进样瓶中。
分析条件：色谱柱：日立855-4507型（60 mm×4.6 mm，3 μm）；反应柱温：135 ℃；柠檬酸（锂）PBF缓冲液梯度洗脱；检测波长：570 nm+440 nm；流速：洗脱泵0.35 mL/min，衍生泵0.30 mL/min；分析时间：148 min[21]。
1.2.4.2 HS-SPME/GC-MS测定挥发性成分
HS-SPME方法萃取样品挥发性成分：取样品2 g于50 mL顶空瓶，以环己酮作为内标，密封，90 ℃平衡5 min，插入已经活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，顶空吸附30 min，插入GC进样口解析3 min[22]。
色谱条件：DB-WAX色谱柱（60 mm×0.32 mm，0.25 μm），载气为氦气，流速1 mL/min，设置升温程序条件为：进样口温度为250 ℃，色谱柱初始温度为50 ℃保持2 min，接下来以3 ℃/min的速度上升至220 ℃，保持5 min，不分流进样。
质谱条件：电离方式：EI，发射电流：80 μA，电子能量为：70 eV，扫描范围为m/z 30~400，离子源温度：230 ℃，接口温度：240 ℃。
定量分析：根据被测化合物和内标物环己酮相应的色谱峰面积之比，计算被测组分的相对含量，表示为μg/kg，计算公式如下：
式中：Mc为化合物相对含量（μg/kg）；ST：总离子流图中化合物峰面积；C标：内标物质浓度（μg/mL）；S标：内标物质峰面积；V标：内标物加入的体积（μL）；m：样品质量（kg）。
1.2.4.3 电子鼻测定气味强度的变化
分别称取不同发酵阶段的淡豆豉样品3.0 g，装入密封塑料杯中，室温平衡30 min后，插入电子鼻的进样针头进行测定。测定条件：采样时间1 s/组；传感器自清洗时间120 s；传感器归零时间10 s；样品准备时间5 s；进样流量400 mL/min；分析采样时间120 s[23]。采用电子鼻内置程序（Winmuster，version 1.6.2）进行数据处理与分析，传感器灵敏物质分类见表1。
表 1 传感器灵敏物质分类Table 1. Sensor sensitive material classification序号 传感器类别 灵敏物质 1号 W1C 芳香成分，苯类 2号 W5S 氮氧化合物 3号 W3C 芳香成分 4号 W6S 氢化物 5号 W5C 短链烷烃芳香成分 6号 W1S 甲基类 7号 W1W 硫化物 8号 W2S 醇类、醛酮类 9号 W2W 芳香成分&有机硫化物 10号 W3S 长链烷烃 1.3 数据处理
数据结果采用SPSS 26、GraphPad Prism 8和DPS 7.0等统计分析软件进行数据分析及显著性分析并作图。
2. 结果与分析
2.1 不同发酵方式发酵过程中pH和菌落总数的变化
淡豆豉发酵是酸性发酵，pH会直接影响豉曲中蛋白酶的活性及微生物的生长和代谢，酸性环境有利于酸性和中性蛋白酶等酶系的积累及淡豆豉后发酵过程中苦味脱除[24-25]。由图1A可知，根霉发酵pH由发酵前的6.59下降至发酵后的6.35，而混菌发酵pH持续下降，从6.59下降至5.96。总酸含量变化如图1B所示，发酵自第3 d开始，混菌发酵所产总酸含量大于根霉发酵，后虽有波动，但最终混菌发酵总酸含量仍高于根霉发酵，乳酸在发酵所产生的有机酸中酸性较强，故推测混菌发酵中后期乳酸菌大量繁殖产生了乳酸导致pH持续下降。菌落总数变化如图1C所示，发酵第1 d，发酵微生物数量已达到较大基数，而随发酵的进行，微生物总数总体呈上升趋势，整个发酵过程中根霉和乳酸菌未出现较大的起伏，另外发酵过程中未检测到其他杂菌，说明发酵过程稳定进行。
2.2 不同发酵方式发酵过程中基本成分变化
由表2可知，两种发酵方式发酵前和发酵后的基本成分都发生了变化，根霉和混菌发酵前后，总糖的含量都显著降低（P<0.05），还原糖、总酸、氨基酸态氮和灰分的含量显著提高（P<0.05）。根霉发酵蛋白质显著降低（P<0.05），混菌发酵蛋白质显著升高（P<0.05）；根霉发酵前后对脂肪含量变化影响不明显，而混菌发酵却显著提高了脂肪的含量（9.10%）。产生这些变化的原因可能是发酵过程中根霉等微生物分泌淀粉酶将淡豆豉中的淀粉水解，超过微生物的消耗量，还原糖上升，总糖被水解为单糖被微生物利用，总体呈下降趋势；由于根霉等微生物产生大量的蛋白酶，使得淡豆豉中蛋白质被分解成小分子多肽和氨基酸等可溶性含氮物，氨基态氮含量逐渐增加；前期总酸含量逐渐增加，可能是因为根霉生长代谢的次生产物有机酸或脂肪酸造成的[26]，混菌发酵脂肪含量提高的原因可能是乳酸芽孢杆菌分泌物对脂肪酸等物质的氧化具有一定的抑制作用[27]。
表 2 不同发酵方式对淡豆豉基本成分的影响Table 2. Effects of different fermentation methods on basic components of SSP基本成分 根霉发酵 混菌发酵 发酵前
(第0 d)发酵后
(第9 d)发酵前
(第0 d)发酵后
(第9 d)总糖(mg/g) 235.37±4.71 161.42±8.69* 234.37±4.22 173.24±8.66* 还原糖(mg/g) 22.21±1.05 28.69±1.17* 22.21±1.05 28.39±1.33* 总酸(g/100 g) 0.78±0.17 1.64±0.20* 0.61±0.05 1.81±0.15* 蛋白质(g/100 g) 55.21±0.05 46.43±0.08* 45.54±0.43 47.22±0.33* 氨基酸态氮(g/100 g) 0.79±0.17 1.05±0.05* 0.80±0.20 0.93±0.09* 脂肪 (g/100 g) 20.73±0.37 20.85±0.84 20.89±0.40 22.79±0.05* 灰分(g/100 g) 4.70±0.05 5.17±0.05* 4.69±0.03 5.04±0.10* 注：*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。 2.3 不同发酵方式对淡豆豉活性物质的影响
大豆异黄酮广泛存在于豆类食品中，是豆类重要的生物活性物质，如图2A所示，发酵过程中大豆异黄酮含量升高，且混菌发酵大豆异黄酮含量高于根霉发酵，根霉发酵大豆异黄酮含量由2.31 mg/g增加至3.20 mg/g；而混菌发酵大豆异黄酮含量由2.25 mg/g增加至3.91 mg/g，线性方程及相关系数见表3，两种发酵模式大豆异黄酮含量均高于曹冬英等[28]报道的四种市售黑豆成品淡豆豉（异黄酮最高含量1.64 mg/g）中异黄酮的含量，但是低于赵佳琪等[29]以马料豆为发酵原料所发酵的淡豆豉（4.37 mg/g）中的异黄酮的含量，可能是由于马料豆中的异黄酮含量本身高于雄黑豆。γ-氨基丁酸是一种非蛋白质组成天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统首要抑制性神经递质，具有镇静、抗焦虑、增强记忆及改善睡眠的作用，对抑郁、失眠、自主神经失调等疾病有明显改善作用[30]，如图2B所示，发酵能够有效提高γ-氨基丁酸的含量，但混菌发酵γ-氨基丁酸的含量低于根霉发酵，混菌发酵γ-氨基丁酸最终含量为3.03 mg/g，较发酵前增加1.11 mg/g，根霉发酵γ-氨基丁酸最终含量为4.83 mg/g，较发酵前增加3.09 mg/g，这可能是由于低酸导致γ-氨基丁酸不稳定。豆豉溶栓酶具有良好的降血栓作用，是继纳豆激酶之后发现的一种具有强烈溶解血栓纤维蛋白功能的丝氨酸蛋白酶[3]，如图2C所示，在发酵过程中溶栓酶活性呈增长趋势，且混菌发酵整体高于根霉发酵，发酵第9 d活性达到最大值，其中混菌发酵淡豆豉溶栓酶活性为3927.84 IU/g，较发酵前增加3414.82 IU/g；根霉发酵淡豆豉溶栓酶活性为2152.20 IU/g，较发酵前增加1621.04 IU/g。结果表明，混菌发酵淡豆豉溶栓酶活性明显高于根霉发酵淡豆豉。
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图 2 不同发酵方式对淡豆豉活性成分的影响Figure 2. Effects of different fermentation methods on active components of SSP表 3 大豆异黄酮线性方程Table 3. Linear equation of soybean isoflavone标品 线性方程 线性范围
(mg·L−1)相关
系数检出限
(mg·kg−1)定量限
(mg·kg−1)大豆苷 y=34540.61x−3281.05 10~50 0.9996 0.5 2 黄豆黄苷 y=32157.81x−1406.71 10~50 0.9995 0.5 2 染料木苷 y=40123.29x−7844.62 10~50 0.9995 0.4 1.5 大豆素 y=53625.97x−1983.25 10~50 0.9994 0.4 1.5 黄豆黄素 y=49474.73x−6571.28 10~50 0.9993 0.4 1.5 染料木素 y=69162.16x−2219.22 10~50 0.9994 0.4 1.5 2.4 不同发酵方式对淡豆豉风味的影响
2.4.1 不同发酵方式对游离氨基酸的影响
为了更好比较混菌发酵和根霉发酵过程中氨基酸的呈味组成情况，参考索化夷等[31]的方法，将氨基酸分为鲜味（天门冬氨酸、谷氨酸）、甜味（苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸）、苦味（缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸）和无味（赖氨酸）4类。淡豆豉风味与蛋白质水解有一定关系，蛋白质水解形成强烈疏水的肽和大部分苦味氨基酸[32]，但同时也形成了鲜味氨基酸和甜味氨基酸，有助于弱化淡豆豉苦味，形成淡豆豉特殊风味。发酵过程中各类风味氨基酸的变化结果如图3所示，各类氨基酸随着发酵进行，含量都有所增加，说明发酵过程中，蛋白质不断降解成氨基酸，并形成不同的风味，但根霉发酵和混菌发酵前后对比，风味氨基酸的含量差距不明显。
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图 3 发酵过程中豆豉游离氨基酸分类汇总Figure 3. Classification and summary of free amino acids in SSP during fermentation2.4.2 不同发酵方式对挥发性物质的影响
采用顶空-固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）对两种发酵过程中的挥发性风味物质进行分析[33-34]。两种发酵方式的总离子图如图4所示，其中两种发酵方式中挥发性成分种类大体相似。为了更好地统计挥发性物质的变化情况，对所有检测出来的挥发性物质进行归类处理，分为烷烃类、吡嗪类、醇类、酯类、酚类、烯烃类、醛类、酮类和其他类。如图5所示，在乳酸菌的作用下，混菌发酵淡豆豉的吡嗪类、醇类物质含量下降，醛类、酚类、烷烃类物质含量上升。根霉发酵和混菌发酵均检测出7种烷类成分，且种类相同，但混菌发酵中烷类成分的总量高于根霉发酵（图5A）。淡豆豉烷烃类主要成分包括十二烷、正十四烷、正十六烷和壬基环己烷是其主要烷烃类成分，呈先增加后减少趋势，十二烷具有乳酪味[35]。吡嗪是由蛋白质或氨基酸的热分解和蛋白质或氨基酸与糖的美拉德反应产生的[36]，阈值较低，所以低浓度的吡嗪类化合物对样品的风味影响较大。如图5B所示，根霉发酵和混菌发酵淡豆豉最终吡嗪含量分别为72.63 μg/kg和55.46 μg/kg。添加乳酸菌发酵有利于减少淡豆豉发酵过程中的吡嗪类物质含量，吡嗪类物质阈值较低，天然发酵食品中低吡嗪含量多可呈优良风味，而高含量的吡嗪是纳豆氨臭味和腐败味的主要来源[37]。在混菌发酵中检测到癸醚，其含量最高达4.13 μg/kg，醚类化合物中含有苯环的醚大多具有独特芳香味[38]。其他风味成分在发酵过程中都呈现出波动变化的趋势，总之，两种发酵方式随着发酵时间的进行，风味物质不断得更新，最终发酵完成后呈现出淡豆豉独有的发酵风味。
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图 4 淡豆豉发酵过程中挥发性成分总离子图Figure 4. Total ions of volatile components in SSP fermentation process![]()
图 5 不同发酵方式发酵过程中挥发性物质变化Figure 5. Changes of volatile substances in different fermentation methods2.4.3 电子鼻风味分析
采用德国PEN3型电子鼻对根霉发酵和混菌发酵第0、1、3、5、7、9 d的样品进行分析，同一样品各个传感响应器取平均值分析后，绘制成雷达图如图6A所示。从响应值变化程度判断，淡豆豉样品挥发性风味成分响应值主要集中在传感器7号、6号、9号、2号、8号（响应值>2），其中7号响应值最高，表明硫化物、甲基类化合物、芳香化合物、有机硫化物、氮氧化合物及醇类、酮类化合物对淡豆豉风味贡献率较大[39]，这与挥发性物质烷烃类物质的含量最高结果相一致。其他相关挥发物类型含量较低，同时发现根霉发酵比混菌发酵淡豆豉样品整体风味更浓，其中根霉发酵第5 d淡豆豉响应值最大。
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图 6 淡豆豉风味雷达图和聚类图注：B图的G代表单独根霉发酵淡豆豉；H代表混菌发酵淡豆豉。Figure 6. Radar map and cluster map of SSP flavor据图6A电子鼻数据进行PCA主成分分析和k-mean聚类分析结果发现，第一和第二主成分总贡献率达到98.69%（第一主成分分析贡献率为97.29%，第二主成分分析贡献率为1.40%），说明第一主成分可反应样品的大部分特征（图6B）。从样品特征聚类分析判断，每种淡豆豉样本数据离散程度较低，样品检测重现性较好。从样品之间距离判断，样品可分为三类，根霉发酵第0 d和第1 d为一类，混合发酵第0 d至第9 d为一类，除第7 d外其余天数重叠部分多，表明混菌发酵第7 d风味物质与混菌发酵其余天数风味物质具有一定差异；根霉发酵第3、5、7、9 d为一类，且离散程度大，表明根霉发酵后淡豆豉风味差异较大。
3. 结论
本研究探讨不同的发酵方式对淡豆豉的品质和风味的影响，通过HS-SPME/GC-MS和电子鼻等方法评价不同发酵模式的淡豆豉风味及品质的影响。结果表明两种发酵模式淡豆豉之间的基本成分差别不大；混菌发酵相较于根霉发酵其溶栓酶活性提升82.50%，大豆异黄酮含量提升22.05%；混菌发酵降低了鲜味氨基酸和吡嗪等物质的含量，减少了腥味和腐败风味，降低了W1W传感器检测到的硫化物气味浓度，改善了淡豆豉的不良风味。因此，将中国根霉12和乳酸芽孢杆菌DU106应用于淡豆豉的生产中，很大程度上改良了淡豆豉的风味，提高了淡豆豉的品质，为淡豆豉工业化应用提供理论指导。
目前混菌发酵菌株间的相互作用机制尚不清楚，所以监测不同菌种发酵过程中的成分变化，探究不同菌种在发酵过程中的相互作用，或者改良菌种等研究都是提升淡豆豉品质和风味的研究方向。
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图 1 不同发酵方式对pH、总酸和菌落总数变化对比
Figure 1. Comparison of different fermentation methods on pH, total acid and total number of bacteria
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图 2 不同发酵方式对淡豆豉活性成分的影响
Figure 2. Effects of different fermentation methods on active components of SSP
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图 3 发酵过程中豆豉游离氨基酸分类汇总
Figure 3. Classification and summary of free amino acids in SSP during fermentation
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图 4 淡豆豉发酵过程中挥发性成分总离子图
Figure 4. Total ions of volatile components in SSP fermentation process
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图 5 不同发酵方式发酵过程中挥发性物质变化
Figure 5. Changes of volatile substances in different fermentation methods
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图 6 淡豆豉风味雷达图和聚类图
注：B图的G代表单独根霉发酵淡豆豉；H代表混菌发酵淡豆豉。
Figure 6. Radar map and cluster map of SSP flavor
表 1 传感器灵敏物质分类
Table 1 Sensor sensitive material classification
序号 传感器类别 灵敏物质 1号 W1C 芳香成分，苯类 2号 W5S 氮氧化合物 3号 W3C 芳香成分 4号 W6S 氢化物 5号 W5C 短链烷烃芳香成分 6号 W1S 甲基类 7号 W1W 硫化物 8号 W2S 醇类、醛酮类 9号 W2W 芳香成分&有机硫化物 10号 W3S 长链烷烃 
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表 2 不同发酵方式对淡豆豉基本成分的影响
Table 2 Effects of different fermentation methods on basic components of SSP
基本成分 根霉发酵 混菌发酵 发酵前
(第0 d)发酵后
(第9 d)发酵前
(第0 d)发酵后
(第9 d)总糖(mg/g) 235.37±4.71 161.42±8.69* 234.37±4.22 173.24±8.66* 还原糖(mg/g) 22.21±1.05 28.69±1.17* 22.21±1.05 28.39±1.33* 总酸(g/100 g) 0.78±0.17 1.64±0.20* 0.61±0.05 1.81±0.15* 蛋白质(g/100 g) 55.21±0.05 46.43±0.08* 45.54±0.43 47.22±0.33* 氨基酸态氮(g/100 g) 0.79±0.17 1.05±0.05* 0.80±0.20 0.93±0.09* 脂肪 (g/100 g) 20.73±0.37 20.85±0.84 20.89±0.40 22.79±0.05* 灰分(g/100 g) 4.70±0.05 5.17±0.05* 4.69±0.03 5.04±0.10* 注：*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。
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表 3 大豆异黄酮线性方程
Table 3 Linear equation of soybean isoflavone
标品 线性方程 线性范围
(mg·L−1)相关
系数检出限
(mg·kg−1)定量限
(mg·kg−1)大豆苷 y=34540.61x−3281.05 10~50 0.9996 0.5 2 黄豆黄苷 y=32157.81x−1406.71 10~50 0.9995 0.5 2 染料木苷 y=40123.29x−7844.62 10~50 0.9995 0.4 1.5 大豆素 y=53625.97x−1983.25 10~50 0.9994 0.4 1.5 黄豆黄素 y=49474.73x−6571.28 10~50 0.9993 0.4 1.5 染料木素 y=69162.16x−2219.22 10~50 0.9994 0.4 1.5
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