四川泡菜中潜在益生性植物乳杆菌的筛选及安全性评价

史梅莓; 伍亚龙; 杨恺; 吕鹏军; 汪冬冬; 唐垚; 王勇; 张其圣

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022010227

四川泡菜中潜在益生性植物乳杆菌的筛选及安全性评价

史梅莓^1,,
伍亚龙^{2, 3, +,},
杨恺¹,
吕鹏军¹,
汪冬冬³,
唐垚³,
王勇^{2, 3},
张其圣^{1, 3, ,}

1.
四川省食品发酵工业研究设计院有限公司，四川成都 611130
2.
四川益动源生物科技有限公司，四川眉山 620000
3.
四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川眉山 620000

基金项目: 泡菜产业科技服务平台建设（2021ZHFP0132）；泡菜现代加工连续工艺标准化控制研究与应用（2020YFN0047）。

详细信息

作者简介:
史梅莓（1996−），女，硕士，助理工程师，研究方向：益生菌，E-mail：15881657280@163.com

伍亚龙（1990−），男，本科，高级工程师，研究方向：传统发酵食品微生物应用研究及益生菌功能食品，E-mail：probioticff@163.com

通讯作者:
张其圣（1983−），男，博士，正高级工程师，研究方向：泡菜微生物，E-mail：bigbeastone@163.com

+并列第一作者

中图分类号: TS201.3
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出版历程
- 收稿日期: 2022-01-24
- 网络出版日期: 2022-09-12
- 刊出日期: 2022-11-14

Screening and Safety Evaluation of Potential Probiotic Lactobacillus plantarum in Sichuan Paocai

SHI Meimei^1,,
WU Yalong^{2, 3, +,},
YANG Kai¹,
LÜ Pengjun¹,
WANG Dongdong³,
TANG Yao³,
WANG Yong^{2, 3},
ZHANG Qisheng^{1, 3, ,}

1.
Sichuan Food and Fermentation Industry Research & Design Institute Co., Ltd., Chengdu 611130, China
2.
Sichuan Eden Biology Technology Co., Ltd., Meishan 620000, China
3.
Sichuan Dongpo Chinese Paocai Industrial Technology Research Institute, Meishan 620000, China

摘要

摘要: 为筛选具有潜在益生作用和安全性的植物乳杆菌，以四川泡菜中分离的114株植物乳杆菌为出发菌株，进行耐酸性、耐胆盐能力、耐模拟胃肠液能力、自聚能力、致病菌共聚性、抗生素耐药性和溶血性研究。经过pH2.0酸性条件、0.2%浓度胆盐培养后，初步筛选出13株耐受能力较好的菌株。对13株菌进行模拟胃肠液、聚集能力、耐药性和溶血性试验。结果表明，13株菌模拟胃肠液耐受存活率均高于75%，自聚集能力23%~52%，与致病菌单增李斯特菌和大肠埃希氏菌的共聚集能力分别为10%~29%和16%~37%。在药敏和最小抑菌浓度（MIC）试验中，潜力菌株对10种常见抗生素的耐药性表现基本一致，对β-内酰胺类、酰胺醇类抗生素较敏感，对氨基糖苷类、喹诺酮类、糖肽类、大环内酯类和四环素类抗生素有较强耐受性；13株菌均无溶血现象，说明具有一定的安全性。因此，筛选得到的13株植物乳杆菌均有潜在的益生作用和较高安全性，研究结果为益生菌的开发提供了菌种资源。
- 植物乳杆菌 /
- 益生作用 /
- 药敏 /
- 最小抑制浓度 /
- 模拟胃肠液 /
- 耐酸 /
- 耐胆盐
Abstract: In order to screen L. plantarum with potential probiotic effect and safety, 114 strains of L. plantarum isolated from Sichuan Paocai were used as starting strains to conduct acid resistance, bile salt tolerance, resistance to simulated gastrointestinal fluid, auto-aggregation ability, pathogenic bacteria co-aggregation, antibiotic resistance and hemolytic research. After culturing in pH2.0 acidic conditions and 0.2% bile salt concentration, 13 strains with better tolerance were initially screened. The 13 strains were tested with simulated gastroenteric fluid, aggregation capacity, antibiotic resistance and hemolysis. The results showed that 13 strains simulated gastrointestinal fluid tolerance survival rate was higher than 75%, auto-aggregation ability 23%~52%, and the co-aggregation ability of pathogenic bacteria Listeria monocytogenes and Escherichia coli were 10%~29% and 16%~37%. The results of drug sensitivity and minimum inhibitory concentration (MIC) tests showed that the potential strains showed similar resistance to 10 common antibiotics in drug susceptibility and minimum inhibitory concentration (MIC) experiments. They were sensitive to β-lactam and amido alcohol antibiotics, and had strong resistance to aminoglycosides, quinolones, glycopeptides, macrolides and tetracycline antibiotics. There was no hemolysis phenomenon, indicating high safety. Therefore, the 13 strains of L. plantarum obtained from the primary screening had potential probiotics and high safety, and the research results would provide strain resources for the development of probiotics.
- Lactobacillus plantarum /
- probiotic effect /
- drug sensitivity /
- minimum inhibitory concentration /
- simulate gastrointestinal fluid /
- acid resistance /
- bile salt tolerance

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国际益生菌和益生元科学协会将益生菌定义为一类活的微生物，当摄入足够量时，可以为宿主带来健康益处。据统计，2019年全球益生菌市场价值约400亿欧元，近几年我国益生菌市场平均年增速约15%，预计2022年我国益生菌市场规模接近900亿元，拥有巨大的市场空间^[1]。目前，研究表明益生菌具有多种益生作用，尤其是在调节胃肠道菌群、机体免疫力方面有了相对充实的理论基础与临床研究，其健康作用已被消费者普遍认可^[2]。在未来，筛选并评价更多优良功能菌株，开发差异化菌种以及特异性产品成为益生菌发展趋势之一。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）作为人体肠道内的优势菌之一，大量研究表明具有调节肠道微生物菌群平衡、改善人体免疫力、拮抗致病菌感染、抗氧化性等多种功效^[3-4]，在食品、医疗保健、饲料等领域被广泛应用，国内外学者对其益生功能和临床研究越来越深入。植物乳杆菌来源广泛，研究人员从天然原料奶、传统奶制品、泡菜、地方特色发酵饮料等^[5-6]食品中分离筛选出具有某种功能特性的菌株。四川泡菜是我国典型的传统发酵食品，以多代循环发酵工艺制作的典型四川泡菜，其新制泡菜会逐步演变为一个稳定的含有大量乳酸菌、酵母菌等微生物菌群结构单一和氨基酸、有机酸等底物稳定的生态系统^[7]，其中主导四川泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌（93.89%），如植物乳杆菌、耐酸乳杆菌、短乳杆菌等^[8]。研究表明分离自四川泡菜中的乳酸菌具有高产γ-氨基丁酸、良好的免疫活性、润肠通便功能等特性，如朱珺等^[9]研究发现分离自四川农家泡菜的植物乳杆菌581具有良好胃肠道环境耐受能力，具有润肠通便功能和良好的发酵特性；彭灯水等^[10]从四川泡菜中分离出一株植物乳杆菌LC-13，发现其具有较强的抗逆能力以及较好的益生菌潜力。因此，四川泡菜发酵后期以植物乳杆菌为主导的耐酸性优势菌^[11]，非常值得挖掘。目前，多数研究主要是对四川泡菜中用于泡菜发酵功能菌的筛选^[12]，而针对四川泡菜中可能存在的具有益生潜质的植物乳杆菌及其功能特性研究还远远不足。本研究对分离自传统四川泡菜的114株植物乳杆菌进行耐酸、耐胆盐初筛，通过对其筛选菌模拟胃肠液耐受能力、自聚性和共聚性、体外安全性等指标进行益生作用和安全性评价，以期为后续挖掘优良功能性菌株以及益生菌产品的开发提供理论基础和数据支持。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

114株植物乳杆菌　为实验室保藏菌种，分离自四川多代泡菜（编号PC开头代表泡菜）；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）　四川省食品发酵工业研究设计院有限公司实验室保藏；单增李斯特菌（Listeria monocytogenes CICC21633）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli CICC10305）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CICC23926）　购自中国工业微生物菌种保藏中心；MRS肉汤培养基　广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠、盐酸、氢氧化钠　成都市科隆化学品有限公司；胰蛋白酶（1:250）、胃蛋白酶（1:3000）、哥伦比亚血琼脂平板　生工生物工程（上海）股份有限公司；抗菌药物药敏纸片（10种）　杭州微生物试剂有限公司；牛胆盐（胆酸含量≥60%）、四环素、氨苄青霉素钠等　上海源叶生物科技有限公司。

ESJ200-4A电子天平　沈阳龙腾电子有限公司；XH-B旋涡混合器　江苏天翎仪器有限公司；LDZF-75L-II立式压力蒸汽灭菌器　上海申安医疗器械厂；BSP-150生化培养箱、GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱　上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1FD洁净工作台　苏州安泰空气技术有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅　北京中兴伟业仪器有限公司；FC型酶标仪　赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 耐酸能力的测定

将活化2次后的114株植物乳杆菌分别以10%的接种量接种于pH2.0 MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，分别在培养2和4 h取发酵液稀释至合适梯度后接种至MRS固体培养基，37 ℃培养24 h后活菌计数，对照组为酸处理0 h的活菌数，计算植物乳杆菌的存活率。存活率计算公式如下：

存 活 率 酸 处 理 或 活 菌 数 酸 处 理 的 活 菌 数

$\mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{率}(\mathrm{\text{%}})=\frac{\mathrm{酸}\mathrm{处}\mathrm{理}2\mathrm{ }\text{ h}(\mathrm{或}4\mathrm{ }\text{ h})\mathrm{活}\mathrm{菌}\mathrm{数}(\mathrm{C}\mathrm{F}\mathrm{U}/\mathrm{m}\mathrm{L})}{\mathrm{酸}\mathrm{处}\mathrm{理}0\text{ h}\mathrm{的}\mathrm{活}\mathrm{菌}\mathrm{数}(\mathrm{C}\mathrm{F}\mathrm{U}/\mathrm{m}\mathrm{L})}\times 100$

1.2.2 耐胆盐能力的测定

将活化后的114株植物乳杆菌分别以10%的接种量接种于含0.2 g/100 mL牛胆盐的MRS培养液中，37 ℃静置培养，分别在培养1和3 h取发酵液稀释至合适梯度后接种至MRS固体培养基，37 ℃培养24 h后活菌计数，以未经胆盐处理的MRS培养基菌落数为对照。

1.2.3 耐模拟胃肠液能力的测定

参考丁诗瑶等^[13]的方法，模拟胃液的配制：用NaOH溶液将1 mol/L HCl溶液pH调至2.0，加入胃蛋白酶使其终浓度为1 g/100 mL，0.22 μm微孔滤膜除菌。模拟肠液的配制：用NaOH溶液将磷酸二氢钾溶液pH调至6.8，加入胰蛋白酶使其终浓度为1 g/100 mL，磷酸二氢钾溶液终浓度为0.68 g/100 mL，0.22 μm微孔滤膜除菌。

分别取13株菌的菌液0.5 mL加至4.5 mL模拟胃液或肠液中，在37 ℃静置培养0和3 h取发酵液稀释至合适梯度后接种至MRS固体培养基，37 ℃培养24 h后活菌计数，计算植物乳杆菌的存活率，以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照。存活率计算公式如下：

存 活 率 时 活 菌 数 时 活 菌 数

$\mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{率}(\mathrm{\text{%}})=\frac{3\text{ h}\mathrm{时}\mathrm{活}\mathrm{菌}\mathrm{数}(\mathrm{C}\mathrm{F}\mathrm{U}/\mathrm{m}\mathrm{L})}{0\text{ h}\mathrm{时}\mathrm{活}\mathrm{菌}\mathrm{数}(\mathrm{C}\mathrm{F}\mathrm{U}/\mathrm{m}\mathrm{L})}\times 100$

1.2.4 自聚集能力和共聚性的测定

参考Behrooz等^[14]的方法。将活化后的13株菌6000 r/min离心10 min，用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS清洗2次，重新悬浮于PBS中，调整细菌悬液浓度约为10⁸ CFU/mL，取菌悬液测定A_{620 nm}，记为A₀。菌悬液37 ℃静置培养5 h后取上清液，测定A_{620 nm}，记为A₁。自聚集能力计算公式如下：

$\mathrm{自}\mathrm{聚}\mathrm{集}\mathrm{能}\mathrm{力}(\mathrm{\text{%}})=\left(1-\frac{\mathrm{A}_\text{1}}{\mathrm{A}_\text{0}}\right)\times 100$

共聚性的测定：以大肠杆菌CICC10305、单增李斯特菌CICC21633对植物乳杆菌的共聚集能力进行评价。将植物乳杆菌与致病菌菌悬液等体积混合均匀，37 ℃静置培养5 h后取上清液，测定A_{620 nm}。共聚性计算公式如下：

$\mathrm{共}\mathrm{聚}\mathrm{性}(\mathrm{\text{%}})=\dfrac{\dfrac{\mathrm{A}_\text{2}+\mathrm{A}_\text{3}}{2}-\mathrm{A}_\text{混}}{\dfrac{\mathrm{A}_\text{2}+\mathrm{A}_\text{3}}{2}}\times 100$

式中：A₂、A₃分别为植物乳杆菌、致病菌在0 h时的吸光值；A_混为植物乳杆菌与致病菌混合液处理5 h的吸光值。

1.2.5 体外安全性评价

1.2.5.1 药物敏感性

采用纸片扩散法（K-B法），将活化后的13株菌经适当的梯度稀释（菌液浓度约为1×10⁸ CFU/mL），均匀地涂布于MRS平板上，用无菌镊子将药敏纸片均匀放置其上，37 ℃培养24 h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。用标准敏感菌株金黄色葡萄球菌CICC23926作为质控菌，参照美国临床实验室标准化协会^[15]对抗菌药物敏感性的最小抑菌圈直径大小来判定菌株的药敏性。

1.2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）的测定

采用宏量肉汤稀释法测定各菌株MIC。取菌液加入10种抗生素溶液中（最终细菌浓度约为5×10⁵ CFU/mL），以不加抗生素的MRS液体培养基试管作为对照，混匀后测量各试管A_{620 nm}值。37 ℃培养24 h后，肉眼观察有无可见菌生长，并测定A_{620 nm}值。结果根据欧洲食品安全局（EFSA）的指南^[16]、欧洲抗菌素敏感性试验委员会（EUCAST）^[17]、美国临床实验室标准化协会（CLSI）颁布的标准中临界值或耐药折点进行判断^[15]。

1.2.5.3 溶血性试验

参考高熳熳等^[18]的方法，将活化后的13株菌株划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，观察是否出现溶血现象。以金黄色葡萄球菌CICC23926作为阳性对照菌株。

1.3 数据处理

所有试验均重复三次，数据结果用平均值±标准差表示。采用Excel 2019、Origin 2018软件进行数据统计分析和绘制结果图，SPSS Statistics 22软件进行方差分析（ANOVA）和LED检验，以P<0.05判断为具有显著差异。

2. 结果与分析

2.1 耐酸能力

大部分人胃液pH在1.5~3.0，益生菌要在人体肠道内存活并增殖，必须具备一定的耐酸能力。本试验初期以pH2.0的酸性环境下培养2和4 h作为筛选植物乳杆菌的条件，从114株菌中筛选得到13株具有一定耐酸能力的菌株（图1）。13株菌培养2 h后存活率均高于50%，PC05、PC06、PC08、PC09、PC94、PC97菌株在培养4 h后其存活率仍能达到80%以上。其中PC08菌株在培养4 h后存活率由54.57%增加至82.09%（P<0.05），这与聂紫玉等^[19]研究发现49株植物源乳酸菌在pH2.5 MRS培养基中培养4 h后，其中的12株菌活菌数较0 h时增加的结果相似。赵山山等^[20]从贵州家庭自制泡菜中分离出11株植物乳杆菌，经过pH2.0的酸溶液处理2 h后存活率均能达到87%以上。Giri等^[21]从当地传统的大米发酵饮料中筛选出植物乳杆菌L7，在pH2.0的条件下培养4 h其存活率可达89.87%。表明培养4 h后，6株植物乳杆菌存活率达到80%以上，这与其他研究报道具有较强的耐酸性的结果相似。

图 1 植物乳杆菌在pH2.0酸性条件下培养2、4 h的存活率

注：对于同测定指标，字母不同表示差异显著（P<0.05）；图2~图3同。

Figure 1. Survival rate of L. plantarum under pH2.0 acidic conditions for 2 and 4 h

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2.2 耐胆盐能力

胆盐可通过破坏菌体细胞膜和表面特性，影响胞内基质蛋白稳定性、损伤DNA等，正常生理情况下，人小肠中胆盐浓度约为0.03%~0.3%，设定胆盐浓度为0.2 g/100 mL，评价植物乳杆菌的耐受能力。由表1可知，培养1 h时，整体活菌数量均下降，其中PC06、PC08、PC09菌株耐胆盐短时能力偏强，其余菌株耐受能力较低。在培养3 h后，共8株菌具有长时耐受性，其中PC05、PC06、PC100、PC104菌株活菌数能维持在6 lg CFU/mL以上，而其余5株菌无活菌检出。表明13株菌中共有8株菌具有较强的耐胆盐能力（PC05、PC06、PC94、PC97、PC100、PC104、PC105、PC108）。结果与一些报道相似，如周海柱等^[22]从长春民间自制泡菜中筛选出4株植物乳杆菌，其中两株菌在含0.2%牛胆盐的培养基中培养3 h后其活菌数能维持在10⁸ CFU/mL，而其余2株活菌数在10⁵~10⁶ CFU/mL范围内。不同菌株对胆盐的耐受能力不同，这与其自身有关，有的菌株可以通过调控热激蛋白调控系统的基因应对胆盐胁迫导致的蛋白质过量、错误折叠等的不利影响、通过氨基酸代谢提高细胞膜稳定性等适应和对抗胆盐胁迫的机制和系统^[23]。

表 1 植物乳杆菌对0.2 g/100 mL牛胆盐溶液耐受能力

Table 1. Tolerance of L. plantarum to 0.2 g/100 mL bovine bile salt solution

菌株编号	活菌数（lg CFU/mL）
菌株编号	对照组	1 h	3 h
PC05	8.23±0.04^a	7.51±0.04^b	7.50±0.01^b
PC06	8.34±0.03^a	8.33±0.11^a	7.65±0.07^b
PC08	7.68±0.05^a	7.48±0.02^b	ND
PC09	7.75±0.02^a	7.22±0.19^b	ND
PC34	7.73±0.02^a	5.03±0.11^b	ND
PC41	8.17±0.04^a	5.03±0.07^b	ND
PC94	8.31±0.03^a	5.54±0.34^b	5.54±0.09^b
PC95	7.06±0.03^a	4.70±0.28^b	ND
PC97	8.31±0.08^a	6.54±0.08^b	5.69±0.13^c
PC100	8.23±0.09^a	7.39±0.02^b	7.21±0.02^c
PC104	8.29±0.05^a	6.19±0.01^b	6.00±0.13^b
PC105	8.32±0.01^a	6.00±0.12^b	5.85±0.01^b
PC108	7.97±0.04^a	4.76±0.37^b	5.00±0.03^b
注：“ND”表示未生长；表中同一行字母不同表示差异显著（P<0.05）。

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2.3 耐模拟胃肠液能力

人体消化道中的胃蛋白酶和胰蛋白酶可以分解蛋白质，也会对微生物的生长具有一定的抑制作用。植物乳杆菌在人工模拟胃液和肠液的环境下其存活率如图2所示，在模拟胃液中，3 h内菌株存活率均高于75%，其中4株菌存活率达到100%以上，表现出很强的耐受胃液能力。在模拟肠液中，共有9株菌存活率高于100%。郑越等^[24]同样研究表明，6株不同来源的植物乳杆菌培养3 h时，在模拟胃液中的存活率均高于97%，4株菌在肠液中存活率能达到100%以上。说明13株菌对胃肠液均有一定的耐受能力，具有发挥益生功能的潜力。

图 2 植物乳杆菌对模拟胃肠液的耐受能力

Figure 2. Tolerance of L. plantarum to simulated gastrointestinal fluid

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2.4 自聚集能力和共聚性

益生菌要在宿主体内发挥作用必须在肠黏膜上皮细胞中发生黏附并进一步定植，有研究表明自聚性和共聚性较强的菌株，其与肠道上皮的黏附能力也较强^[25]。由图3可知，13株植物乳杆菌自聚集能力在23%~52%。其中，PC97、PC108菌株的自聚集能力达39.92%和51.09%，不同植物乳杆菌之间自聚集能力存在差异性，这与一些研究结果相似，李清等^[26]研究分离自新疆酸马奶、酸驼奶等的10株植物乳杆菌，其中自聚能力最强可达63.39%，5株菌的自聚集能力在20%~30%之间。有研究表明，培养时间即超过某一培养时间后菌株的自动聚集能力不会发生显著性变化，菌体表面成分如碳水化合物、蛋白质与菌株的自动聚集能力也有一定的相关性^[27]。

图 3 植物乳杆菌的聚集能力

Figure 3. Aggregation ability of L. plantarum

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由图3可知，植物乳杆菌分别与致病菌大肠埃希氏菌、单增李斯特菌的共聚集能力存在差异，分别在16%~37%、10%~29%之间。与单增李斯特菌相比，13株植物乳杆菌对大肠埃希氏菌显示出更高的共聚集能力。其中，PC108菌株与大肠埃希氏菌的共聚集值最高（36.66%）。有研究表明共聚集可能是干扰致病菌黏附上皮细胞的重要因素，在共聚集过程中，乳酸菌可以控制致病菌周围的微环境，形成防止致病菌定植的屏障、增加分泌抑制物如细菌素浓度等^[28]。

2.5 体外安全性评价

2.5.1 抗生素药敏性

具有抗生素抗性基因的益生菌被食用后可能向人体内其他细菌或致病菌转移其抗性基因，从而导致对人体健康的潜在风险，因此植物乳杆菌对抗生素的敏感性是体外安全性评价最重要的指标之一^[29]。植物乳杆菌对10种抗生素的敏感性如表2所示，13株菌均对链霉素、万古霉素以及诺氟沙星耐药；对四环素、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、氯霉素均为敏感；对青霉素（6/13，46.15%）敏感，（6/13，46.15%）中度敏感，其中PC108对青霉素耐药；对庆大霉素（11/13，84.61%）耐药，PC41对庆大霉素中度敏感，PC108对庆大霉素耐药。研究结果与许女等^[30]研究中分离自传统发酵食品的97株乳酸菌对链霉素、万古霉素、庆大霉素耐药性较强的结果相似。据报道，乳酸菌对氨基糖苷类抗生素（链霉素、庆大霉素）耐药原因之一是产生的氨基糖苷类钝化酶使此抗生素灭活^[31]。综合上述结果，13株菌对多种抗生素具有敏感性。

表 2 13株植物乳杆菌的抑菌圈直径（mm）及判定结果

Table 2. Diameter of inhibition zone (mm) and judgment results of 13 strains of L. plantarum

菌株编号	抗生素
菌株编号	氨苄西林	阿莫西林	红霉素	链霉素	庆大霉素	四环素	青霉素钠	氯霉素	万古霉素	诺氟沙星
PC05	33.3/S	41.4/S	26.4/S	−/R	10.5/R	20/S	27/I	31.8/S	−/R	7.8/R
PC06	36.6/S	40.2/S	23.8/S	−/R	10.3/R	18.5/S	23.5/I	29.8/S	−/R	−/R
PC08	32.8/S	41.2/S	30.6/S	−/R	8.9/R	24/S	30.5/S	33.5/S	−/R	−/R
PC09	32.7/S	34.1/S	28.9/S	−/R	9.6/R	22/S	27.5/I	32.5/S	−/R	−/R
PC34	30.7/S	36.6/S	30.3/S	−/R	−/R	24.5/S	30/S	33.5/S	−/R	−/R
PC41	39.9/S	43/S	28.3/S	−/R	12.5/I	23/S	35.5/S	31.5/S	−/R	−/R
PC94	28.8/S	31/S	25.5/S	−/R	8/R	19/S	26/I	29.8/S	−/R	−/R
PC95	40.5/S	43.8/S	28.3/S	−/R	8.8/R	25/S	43.8/S	32.3/S	−/R	11/R
PC97	31.2/S	31/S	27.8/S	−/R	9.6/R	18.8/S	28.3/S	30.5/S	−/R	7.5/R
PC100	35.8/S	39.4/S	25/S	−/R	9.1/R	18.5/S	33/S	29.5/S	−/R	−/R
PC104	33.4/S	39.8/S	25.8/S	−/R	8.5/R	22/S	22/I	30.5/S	−/R	−/R
PC105	31.7/S	32.6/S	27.4/S	−/R	9.3/R	20.3/S	20.3/I	29/S	−/R	−/R
PC108	36.5/S	42.2/S	30.6/S	−/R	16.9/S	16.8/S	16.8/R	34.5/S	−/R	−/R
注：R：耐药；I：中度敏感；S：敏感；“−”无药敏圈；质控菌株对实验抗生素的抑菌圈直径均在允许范围内。

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2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）

采用宏量肉汤稀释法进行体外药敏试验结果如表3所示，13株植物乳杆菌对红霉素、氯霉素和青霉素表现出不同程度的耐药性，对3种抗生素的耐药率分别为红霉素（12/13，92.31%）、氯霉素（5/13，38.46%）、青霉素（4/13，30.77%）。13株菌对氨苄西林、阿莫西林全部敏感，对链霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素和诺氟沙星全部耐药。所测菌株对抗生素耐药率从高到低为链霉素=庆大霉素=四环素=万古霉素=诺氟沙星>红霉素>氯霉素>青霉素>氨苄西林=阿莫西林。13株菌耐药性结果与很多研究报道大致相同，如李禤等^[32]分离了8株不同来源的植物乳杆菌，对β-内酰胺类、大环内脂类、四环素类、氯霉素类抗生素敏感，对氨基糖苷类、糖肽类和喹诺酮类等抗生素有抗性。本实验中13株菌对四环素表现为耐药，这与Li等^[33]研究四川泡菜中部分乳酸菌对四环素表现出较强的耐药性结果基本一致。综合上述结果，13株菌对链霉素、万古霉素、诺氟沙星耐药，对氨苄西林、阿莫西林敏感，K-B法和宏量肉汤稀释法（MIC）两种方法结果具有一致性，而对其他抗生素的敏感性两种方法结果存在一定差异。

表 3 13株植物乳杆菌对10种抗生素的MIC检测结果

Table 3. Minimum inhibitory concentrations of 13 L. plantarum strains when exposed to ten antibiotics

菌株编号	MIC范围（µg/mL）
菌株编号	氨苄西林	阿莫西林	红霉素	链霉素	庆大霉素	四环素	青霉素钠	氯霉素	万古霉素	诺氟沙星
PC05	<2/S	<2/S	4-2/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC06	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	32-16/R	16-8/R	>512/R	>512/R
PC08	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	16-8/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC09	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	16-8/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC34	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	256-128/R	64-32/R	32-16/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC41	<2/S	<2/S	<2/S	256-128/R	64-32/R	64-32/R	<2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC94	<2/S	<2/S	4-2/R	>512/R	>512/R	256-128/R	8-4/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC95	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	64-32/R	128-64/R	<2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC97	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	256-128/R	256-128/R	4-2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC100	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	32-16/R	256-128/R	<2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC104	<2/S	<2/S	8-4/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC105	<2/S	<2/S	8-4/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC108	<2/S	<2/S	8-4/R	256-128/R	128-64/R	128-64/R	8-4/S	8-4/S	>512/R	>512/R
注：R：耐药；S：敏感；MIC评判标准为分别参照EFSA（庆大霉素16 µg/mL、链霉素64 µg/mL、万古霉素8 µg/mL、青霉素8 µg/mL、阿莫西林2 µg/mL、诺氟沙星4 µg/mL）、EUCAST（红霉素2 µg/mL、四环素32 µg/mL、氨苄西林2 µg/mL、氯霉素8 µg/mL）。

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2.5.3 溶血性

WHO/FAO在《食品中益生菌评估指南》中建议，溶血性检测是益生菌体外安全性评价中不可缺少的环节。具有溶血性的细菌在补体的作用下，抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行溶解反应，将抗体溶解，进而引发破坏红血球，造成集体严重的溶血反应，进而导致败血症等疾病^[34]。

以金黄色葡萄球菌CICC23926为对照菌株，检测试验中13株植物乳杆菌溶血性（图4）。金黄色葡萄球菌菌落周围出现透明溶血圈，即为溶血，对人体的致病力强。13株植物乳杆菌菌落周围均没有出现溶血圈，即不溶血，由此说明试验菌种无溶血性，结果与一些研究所报道的其他植物乳杆菌未检测出溶血现象一致^[35]。

图 4 溶血试验结果

Figure 4. Results of hemolysis test

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3. 结论

本研究从分离自四川泡菜的114株植物乳杆菌中筛选出13株耐酸和耐胆盐能力菌株，并对其潜在的益生作用和安全性进行了初步研究。结果表明，13株植物乳杆菌显示出良好的人工胃肠道耐受能力和自聚能力，与大肠埃希氏菌的共聚集能力高于单增李斯特菌，均无溶血性；在抗生素药敏性试验中，对链霉素、万古霉素以及诺氟沙星耐药，对四环素、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、氯霉素均为敏感，对青霉素和庆大霉素表现出不同程度的敏感；在测定菌株最小抑制浓度MIC中，所测菌株对抗生素耐药率从高到低为链霉素=庆大霉素=四环素=万古霉素=诺氟沙星>红霉素>氯霉素>青霉素>氨苄西林=阿莫西林。综上所述，13株植物乳杆菌在以不同指标评价时各有侧重，可作为潜在的益生菌菌株应用于食品、动物饲料等领域，同时也说明四川泡菜这一天然益生菌资源宝库非常值得挖掘。在下一步工作中，根据不同需求对表现好的菌株进行全基因组测序，挖掘重要性状相关的功能基因，对其功能性进行进一步探究，以期为获得优良功能性菌株以及益生菌产品的开发奠定理论基础。

图 1 植物乳杆菌在pH2.0酸性条件下培养2、4 h的存活率

注：对于同测定指标，字母不同表示差异显著（P<0.05）；图2~图3同。

Figure 1. Survival rate of L. plantarum under pH2.0 acidic conditions for 2 and 4 h

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图 2 植物乳杆菌对模拟胃肠液的耐受能力

Figure 2. Tolerance of L. plantarum to simulated gastrointestinal fluid

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图 3 植物乳杆菌的聚集能力

Figure 3. Aggregation ability of L. plantarum

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图 4 溶血试验结果

Figure 4. Results of hemolysis test

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表 1 植物乳杆菌对0.2 g/100 mL牛胆盐溶液耐受能力

Table 1 Tolerance of L. plantarum to 0.2 g/100 mL bovine bile salt solution

菌株编号	活菌数（lg CFU/mL）
菌株编号	对照组	1 h	3 h
PC05	8.23±0.04^a	7.51±0.04^b	7.50±0.01^b
PC06	8.34±0.03^a	8.33±0.11^a	7.65±0.07^b
PC08	7.68±0.05^a	7.48±0.02^b	ND
PC09	7.75±0.02^a	7.22±0.19^b	ND
PC34	7.73±0.02^a	5.03±0.11^b	ND
PC41	8.17±0.04^a	5.03±0.07^b	ND
PC94	8.31±0.03^a	5.54±0.34^b	5.54±0.09^b
PC95	7.06±0.03^a	4.70±0.28^b	ND
PC97	8.31±0.08^a	6.54±0.08^b	5.69±0.13^c
PC100	8.23±0.09^a	7.39±0.02^b	7.21±0.02^c
PC104	8.29±0.05^a	6.19±0.01^b	6.00±0.13^b
PC105	8.32±0.01^a	6.00±0.12^b	5.85±0.01^b
PC108	7.97±0.04^a	4.76±0.37^b	5.00±0.03^b
注：“ND”表示未生长；表中同一行字母不同表示差异显著（P<0.05）。

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表 2 13株植物乳杆菌的抑菌圈直径（mm）及判定结果

Table 2 Diameter of inhibition zone (mm) and judgment results of 13 strains of L. plantarum

菌株编号	抗生素
菌株编号	氨苄西林	阿莫西林	红霉素	链霉素	庆大霉素	四环素	青霉素钠	氯霉素	万古霉素	诺氟沙星
PC05	33.3/S	41.4/S	26.4/S	−/R	10.5/R	20/S	27/I	31.8/S	−/R	7.8/R
PC06	36.6/S	40.2/S	23.8/S	−/R	10.3/R	18.5/S	23.5/I	29.8/S	−/R	−/R
PC08	32.8/S	41.2/S	30.6/S	−/R	8.9/R	24/S	30.5/S	33.5/S	−/R	−/R
PC09	32.7/S	34.1/S	28.9/S	−/R	9.6/R	22/S	27.5/I	32.5/S	−/R	−/R
PC34	30.7/S	36.6/S	30.3/S	−/R	−/R	24.5/S	30/S	33.5/S	−/R	−/R
PC41	39.9/S	43/S	28.3/S	−/R	12.5/I	23/S	35.5/S	31.5/S	−/R	−/R
PC94	28.8/S	31/S	25.5/S	−/R	8/R	19/S	26/I	29.8/S	−/R	−/R
PC95	40.5/S	43.8/S	28.3/S	−/R	8.8/R	25/S	43.8/S	32.3/S	−/R	11/R
PC97	31.2/S	31/S	27.8/S	−/R	9.6/R	18.8/S	28.3/S	30.5/S	−/R	7.5/R
PC100	35.8/S	39.4/S	25/S	−/R	9.1/R	18.5/S	33/S	29.5/S	−/R	−/R
PC104	33.4/S	39.8/S	25.8/S	−/R	8.5/R	22/S	22/I	30.5/S	−/R	−/R
PC105	31.7/S	32.6/S	27.4/S	−/R	9.3/R	20.3/S	20.3/I	29/S	−/R	−/R
PC108	36.5/S	42.2/S	30.6/S	−/R	16.9/S	16.8/S	16.8/R	34.5/S	−/R	−/R
注：R：耐药；I：中度敏感；S：敏感；“−”无药敏圈；质控菌株对实验抗生素的抑菌圈直径均在允许范围内。

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表 3 13株植物乳杆菌对10种抗生素的MIC检测结果

Table 3 Minimum inhibitory concentrations of 13 L. plantarum strains when exposed to ten antibiotics

菌株编号	MIC范围（µg/mL）
菌株编号	氨苄西林	阿莫西林	红霉素	链霉素	庆大霉素	四环素	青霉素钠	氯霉素	万古霉素	诺氟沙星
PC05	<2/S	<2/S	4-2/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC06	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	32-16/R	16-8/R	>512/R	>512/R
PC08	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	16-8/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC09	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	128-64/R	128-64/R	16-8/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC34	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	256-128/R	64-32/R	32-16/R	8-4/S	>512/R	>512/R
PC41	<2/S	<2/S	<2/S	256-128/R	64-32/R	64-32/R	<2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC94	<2/S	<2/S	4-2/R	>512/R	>512/R	256-128/R	8-4/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC95	<2/S	<2/S	4-2/R	512-256/R	64-32/R	128-64/R	<2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC97	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	256-128/R	256-128/R	4-2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC100	<2/S	<2/S	8-4/R	512-256/R	32-16/R	256-128/R	<2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC104	<2/S	<2/S	8-4/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	16-8/R	>512/R	>512/R
PC105	<2/S	<2/S	8-4/R	>512/R	256-128/R	128-64/R	4-2/S	8-4/S	>512/R	>512/R
PC108	<2/S	<2/S	8-4/R	256-128/R	128-64/R	128-64/R	8-4/S	8-4/S	>512/R	>512/R
注：R：耐药；S：敏感；MIC评判标准为分别参照EFSA（庆大霉素16 µg/mL、链霉素64 µg/mL、万古霉素8 µg/mL、青霉素8 µg/mL、阿莫西林2 µg/mL、诺氟沙星4 µg/mL）、EUCAST（红霉素2 µg/mL、四环素32 µg/mL、氨苄西林2 µg/mL、氯霉素8 µg/mL）。

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 耐酸能力的测定
1.2.2 耐胆盐能力的测定
1.2.3 耐模拟胃肠液能力的测定
1.2.4 自聚集能力和共聚性的测定
1.2.5 体外安全性评价
1.2.5.1 药物敏感性
1.2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）的测定
1.2.5.3 溶血性试验
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 耐酸能力
2.2 耐胆盐能力
2.3 耐模拟胃肠液能力
2.4 自聚集能力和共聚性
2.5 体外安全性评价
2.5.1 抗生素药敏性
2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）
2.5.3 溶血性
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 耐酸能力的测定
1.2.2 耐胆盐能力的测定
1.2.3 耐模拟胃肠液能力的测定
1.2.4 自聚集能力和共聚性的测定
1.2.5 体外安全性评价
1.2.5.1 药物敏感性
1.2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）的测定
1.2.5.3 溶血性试验
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 耐酸能力
2.2 耐胆盐能力
2.3 耐模拟胃肠液能力
2.4 自聚集能力和共聚性
2.5 体外安全性评价
2.5.1 抗生素药敏性
2.5.2 菌株最小抑制浓度（MIC）
2.5.3 溶血性
3. 结论

参考文献(35)

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四川泡菜中潜在益生性植物乳杆菌的筛选及安全性评价

作者简介: 史梅莓（1996−），女，硕士，助理工程师，研究方向：益生菌，E-mail：15881657280@163.com 伍亚龙（1990−），男，本科，高级工程师，研究方向：传统发酵食品微生物应用研究及益生菌功能食品，E-mail：probioticff@163.com

通讯作者: 张其圣（1983−），男，博士，正高级工程师，研究方向：泡菜微生物，E-mail：bigbeastone@163.com

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