Formation and Characterization of the Complex of Epigallocatechin Gallate and Oat β-Glucan
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摘要: 多酚与膳食纤维间可通过相互作用形成复合物，为了探究多酚与膳食纤维间的相互作用机制及其所形成复合物的结构和形态，本文选用表没食子酸儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）和燕麦β-葡聚糖为原料制备复合物并对其结构进行表征。结果表明：EGCG与燕麦β-葡聚糖复合物的形成与EGCG浓度和pH有关，EGCG与燕麦β-葡聚糖在质量比为0.8:1，pH5的水溶液中可形成粒径为1.7 μm，颗粒相对均一（分散系数为0.38）的复合物；通过透射电镜观察到EGCG与燕麦β-葡聚糖间形成了形貌规整的球状颗粒；等温量热滴定（ITC）分析用于表征EGCG-燕麦β-葡聚糖复合物在pH5和25 °C下的相互作用机制，发现EGCG和燕麦β-葡聚糖之间的结合主要是非共价相互作用中的氢键和疏水相互作用。综上可知，EGCG与燕麦β-葡聚糖能够自发地通过非共价相互作用形成复合物，本研究结果可为不同多酚-燕麦β-葡聚糖复合物作为功能性食品成分或生物活性材料的应用提供理论参考和研究依据。Abstract: Polyphenols and dietary fiber can form complexes through their interactions. In order to investigate the interaction mechanism between polyphenols and dietary fibers, and the structure and morphology of complexes formed by them, this paper selected epigallocatechin gallate and oat β-glucan as the raw materials for the preparation of the complexes and their structural characterization. The results indicated that the formation of the complex of EGCG and oat β-glucan was related to the concentration and pH of EGCG, EGCG and oat β-glucan could form a complex with a particle size of 1.7 μm and a relatively uniform particle size (dispersion coefficient 0.38) in an aqueous solution with a mass ratio of 0.8:1 and pH5. Through transmission electron microscopy, the formation of regular spherical particles between EGCG and BG were clearly observed. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) measurement was used to characterize the EGCG-BG complex. The binding mechanism at 25 °C clearly provided that the binding between EGCG and BG were mainly non-covalent interaction (such as hydrogen bonding and hydrophobic interaction). The above experimental results could indicate that EGCG and BG could spontaneously form a complex through non-covalent interactions. In summary, the findings of this study would provide a theoretical reference and research basis for the use of different polyphenol-oat β-glucan complexes as functional food ingredients or as bioactive materials.
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近年来，由于多酚类化合物在食品工业中的广泛应用，人们对其与食品组分（如蛋白质、多糖等）间的相互作用机制进行了大量研究[1]。表没食子酸儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取的一种茶多酚单体。许多研究表明，EGCG具有抗氧化[2]、影响脂质代谢[3]、抑制肿瘤生长[4]以及降低低密度脂蛋白胆固醇水平[5]的作用，因此常被用作食品添加剂和膳食补充剂[6]。除此之外，EGCG还极易与蛋白质或多糖等大分子物质结合。Liu等[7]通过自由基接枝法制备了乳清分离蛋白（WPI）与EGCG等四种多酚的复合物并对其结构进行表征，结果表明：复合物的抗氧化性能和热稳定性显著高于多酚，并且这四种复合物中WPI-EGCG的功能特性最优；黄国等[8]探究了中性条件下β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白与EGCG的相互作用，得出EGCG与蛋白主要通过氢键和范德华力发生相互作用，且EGCG能够降低这两种蛋白的表面疏水性的结论；有研究表明大豆蛋白肽聚集体（SPA）与EGCG复合制备的纳米颗粒的乳化性以及乳化稳定性优于SPA[9]；然而EGCG不仅能够与蛋白质结合形成复合物，还能够与多糖发生相互作用。Patel等[10]的研究表明EGCG能与甲基纤维素结合形成球形颗粒状的胶体复合物，并在后续的胃肠道模拟消化实验中得出该复合物能够提高EGCG的稳定性，从而保护EGCG在碱性pH下抗氧化性的结论。以上实验结果均表明EGCG-蛋白质/多糖复合物具有优良的抗氧化性和稳定性，并且能有效地控制EGCG这类食品活性成分的包埋及释放，从而提高其生物利用度和营养价值，这在医学、食品工业和人类健康领域具有极其重要的意义。
β-葡聚糖（BG）是一种可溶性线性非淀粉多糖，主要存在于燕麦、大麦以及各种微生物中[11]（包括酵母、真菌、细菌和藻类），由吡喃型葡萄糖单元通过β-（1→3）和β-（1→4）糖苷键连接而成[12]。因其高黏度的特点，在降血糖、降胆固醇[13]、维持肠道健康[14]方面能够发挥良好的生理活性。同时，由于BG良好的功能特性和胶凝特性，其在低脂食品生产领域常被用作稳定剂和脂肪替代品[15]。BG作为一种功能性质良好的可溶性膳食纤维，在功能性食品及生物医药领域具有广阔的应用前景，而BG-配体复合物是否也具有类似燕麦β-葡聚糖的特性，以及其作用机制如何尚未明确，这也是值得研究的重要科学问题。
多酚可以与多糖等大分子物质发生相互作用的这一特性能够提高多酚与多糖的应用潜力，对食品加工具有重要意义。因此本实验选用表没食子酸儿茶素没食子酸酯与燕麦β-葡聚糖结合形成复合物，重点研究EGCG与BG之间复合物的形成机制及结构。采用等温量热滴定仪（ITC）来探究两者相互作用的焓变信息，动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱、X-射线衍射等用于研究复合物的形成及微观结构变化。期望为研究多酚与食品基质间相互作用机制及富含多酚营养型食品的设计提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
燕麦β-葡聚糖（BG） 张家口一康生物科技有限公司，纯度为81.1%；表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG） 源叶生物；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等化学试剂 均为分析纯；纯净水 由Milliq Integral 3系统（德国达姆施塔特Millipore公司）生产。
PHS-3C型pH计 雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司；U-T6A型紫外可见光分光光度计 屹谱仪器制造（上海）有限公司；H1-16KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；CPA225D精密分析电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PEAQ-ITC等温滴定量热仪、Zetasizer Pro纳米粒度及ZETA电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；JEM-1000透射电镜 日本电子株式会社；Thermo Nicolet iN10傅立叶显微红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；DSCQ2000差示扫描仪 美国TA仪器公司；D8 ADVANCE X射线粉末衍射仪 德国布鲁克公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌 巩义市予华仪器有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 EGCG与BG复合物制备
复合物的制备参照李如一[16]的方法并加以修改。EGCG储备液（2.0%）：称取0.6 g EGCG粉末，加入30 mL 超纯水溶液，在磁力搅拌器上搅拌至其充分溶解；BG储备液（2.0%）：称取1.0 g BG粉末，加入50 mL 超纯水溶液，60 ℃条件下磁力搅拌使其充分水化，冷却后将溶液置于离心机8000 ×g离心15 min，即得多糖储备液。
将EGCG储备液稀释至0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%后，与等体积的BG储备液混合，使BG的最终浓度为1.0%，EGCG与BG的质量比为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0。
1.2.2 EGCG与BG复合物的浊度测定
复合物的浊度测定参照李如一[16]与何芸[17]的方法并加以修改。将制备好的EGCG-BG复合物在600 nm处测定吸光值，并将得到的吸光值作为浊度值；根据上一步实验结果，选用EGCG与BG的质量比为0.8的复合物，用1 mol/L NaOH将其pH调至7.0后，用HCl将其pH调至2.0，每调节pH下降0.5时，用UV-vis分光光度计记录溶液在600 nm处测定吸光值，并将得到的吸光值作为浊度值。
1.2.3 EGCG与BG复合物的粒径和电位测定
复合物的粒径分布、电位和多分散系数（PDI）采用动态光散射粒径仪测量。
1.2.4 EGCG结合量测定
EGCG结合量测定参照何芸[17]的方法并加以修改。将制得的复合物于10 kDa超滤离心管中，于10000 ×g下离心15 min。取滤液，稀释后于280 nm处测定吸光值，依据标准曲线：y=15.687x−0.0047（R2=0.9992），计算EGCG的含量。EGCG的标准曲线浓度范围为10~60 ppm。
EGCG结合量(Bindingcapacity，μg/mg)=总EGCG量−游离EGCG量燕麦β−葡聚糖总量 1.2.5 等温量热滴定分析（ITC）
采用等温量热滴定仪测定EGCG与BG相互作用的热力学参数，测定方法参照Zhan等[1]的研究。将40 μL 0.00436 mol/L EGCG溶液每次3 µL分13次滴入200 μL装有pH5.0超纯水或0.00267 mol/L BG溶液的滴定池中（第一次进样为0.4 μL，不计入最终结果），每次滴入持续6 s，每次滴定间隔时间为150 s。滴定池中溶液温度设置为25±0.1 ℃，实验过程中的搅拌速度为750 r/min，以确保充分混合。根据时间，对每次滴加时的吸热或放热的数据进行记录。以EGCG滴定pH5.0超纯水作为空白，并且从原始数据中减去该反应的稀释热。并利用Microcal Origin 7.0软件计算EGCG与BG的相互作用相关的热力学参数，建立“one set of sites”模式来拟合测得的绑定等温线，该模型假设BG上的所有绑定位点都是相同的。
1.2.6 EGCG与BG复合物结构表征
将EGCG与BG质量比为0.8，pH5.0条件下制备好的复合物于10 kDa超滤离心管中，10000 ×g于4 ℃下离心30 min，将未结合的多酚除去，样品冻干备用。
1.2.6.1 傅立叶显微红外光谱
傅立叶显微红外光谱测定参照张李鹏等[18]的方法并加以修改，取一定量的冻干粉末置于金镜上，首先用红外显微镜进行观察，找到样品的位置后调节至合适的测量部位，采集红外光谱图，得到样品红外光谱图。
检测条件：室温，干燥的环境，采用反射模式，扫描范围：4000~650 cm−1, 分辨率：4 cm−1，扫描次数：16，以空白金镜为背景吸收。
1.2.6.2 X-射线衍射分析（XRD）
X-射线衍射参照Han等[19]的方法并加以修改，取一定量的冻干粉末充分研磨至粉末状，放入X-射线衍射仪中进行检测，获得XRD图谱。测定条件为20 ℃，电压40 kV，电流50 mA，石墨单色器，DS/SS=1°，RS=0.3 mm，采用Cu-Kα1辐射，使用多酚、燕麦多糖作为对照。
1.2.6.3 差示扫描量热分析（DSC）
差示扫描量热参照Peng等[20]的方法并加以修改，精确称取一定量的样品粉末放入密封的铝坩埚中，用同样的空坩埚做参照。置于差示扫描量热分析仪中进行分析，温度测试范围为25~200 ℃，升温速度为10 ℃/min，所有的测试均在N2气下进行，吹扫气20 mL/min，保护气60 mL/min。
1.2.6.4 透射电镜（TEM）
透射电镜参照Prasanna等[21]的方法并加以修改，取一滴样品于铜网栅上，4 min后用滤纸吸取多余液体。干燥1 min后，滴加一滴1%乙酸双氧铀于铜网栅表面，染色1 min后，用滤纸吸干多余染色液。将干燥后的样品放入透射电镜电镜中观察。
1.3 数据处理
实验重复三次，结果用平均值±标准偏差的方式表示。采用SPSS 19.0软件，Tukey’s HSD方程进行显著性分析（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 EGCG-BG复合物的形成
2.1.1 EGCG与BG质量比对EGCG-BG复合物形成的影响
以600 nm处的吸光值测定EGCG-BG混合体系的浊度并且作为判断复合物形成的指标[22]，是因为BG和EGCG在该波长下均不存在吸收峰。
在pH5.0条件下，EGCG/BG质量比对混合溶液浊度和外观的影响如图1A、图1B所示。BG浓度固定为1.0%，当EGCG浓度由0.1%增加至0.7%，混合溶液的浊度无明显变化，随着EGCG浓度增加至0.8%，溶液浊度明显增大，并且随着EGCG浓度的继续增加，溶液的浊度也在增大，这表明此时EGCG和BG聚集在一起形成了足够大且可以导致光散射的复合体。除浊度外，还考察了EGCG结合量的变化，如图1C所示，其结合量的变化与浊度变化趋势基本一致。随着EGCG浓度的逐渐增加，EGCG的结合量也在缓慢增大；当EGCG浓度增加至0.8%时，混合溶液的浊度显著增加，同时EGCG结合量增加至60 μg/mg；当EGCG的浓度继续增大，EGCG结合量也随之增大。这一结果表明：EGCG能够与BG形成复合物，且复合物的形成与多酚的浓度有关。
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图 1 不同质量比对EGCG-BG复合物形成的影响注：A：浊度；B：外观；C：EGCG结合量；D：粒径分布。Figure 1. Effect of different mass ratios on the formation of EGCG-BG complex除此之外，EGCG-BG复合物的粒径和电位的变化，如图1D和表1所示。粒径分布图1D的结果表明：EGCG浓度较低时，在100~1000 nm处有较强的峰，1000~10000 nm之间出现了较弱的次峰，这可能是因为EGCG浓度较低只能与部分BG结合形成复合物，当EGCG浓度增加至0.8%时，复合物的粒径也随之增大，粒径分布图可以看出1000~10000 nm处的峰强度增加。同时，100~1000 nm处的峰强度降低，该结果可能是因为EGCG浓度增加能够与更多BG结合形成粒径较大的复合物，结合表1可知，当EGCG与BG质量比高于0.8%时，复合物的粒径仍在继续增大，这可能是复合物之间发生聚集形成了大颗粒聚集体导致的。
表 1 不同质量比下EGCG-BG复合物的平均粒径、多分散指数（PDI）和ζ-电位Table 1. Average particle size, polydispersity index (PDI) and ζ-potential of EGCG-BG complex at different mass ratiosEGCG/BG（w/w） 平均粒径（nm） PDI 平均电位（mV） 0.1 344±16e 1.30±0.10a -6.41±0.03cd 0.2 403±37de 1.06±0.26abc -6.40±0.60cd 0.3 410±30de 1.09±0.13abc -6.81±0.14d 0.4 365±30de 0.94±0.3bcd -5.54±0.58abc 0.5 345±18e 1.16±0.07ab -5.54±0.73abc 0.6 334±22e 1.23±0.07ab -6.06±0.05bcd 0.7 443±22d 0.82±0.12cde -6.34±0.46bcd 0.8 1585±40c 0.51±0.02e -4.90±0.01a 0.9 1742±70b 0.81±0.06cde -5.28±0.15ab 1.0 1912±94a 0.72±0.07de -5.93±0.39bcd 注：同一列不同小写字母表示具有显著性差异（P<0.05）；表2同。 电位的测量结果表明EGCG-BG复合物的带电量较低，约在−4和−7 mV之间（表1），同时随着EGCG浓度的变化，电位变化没有遵循任何规律。有文献表明：多酚与大分子之间的非共价结合可通过静电相互作用、疏水相互作用和氢键等作用力形成[23]，根据结合电位的测量结果可知EGCG与BG复合物的形成与静电相互作用并无必然联系，即静电相互作用不是两者间形成复合物的主要作用力，这一结果与Patel等[24]的研究结果相一致。
2.1.2 pH对EGCG-BG复合物形成的影响
依据EGCG/BG质量比的实验结果，选择了EGCG与BG的质量比为0.8:1进行pH实验，选择pH范围为7.0~2.0。如图2A、图2B所示，随着pH减小，EGCG与BG溶液的浊度呈上升趋势。溶液pH调至6.5时，溶液由澄清透明变浑浊，表明EGCG-BG复合物已经聚集在一起形成较大的颗粒使得浊度发生明显变化；随着pH继续减小溶液的浊度缓慢增大，当体系pH调节至4.0时，复合物的浊度变化进入了一个平台期，继续减小pH溶液的浊度变化不明显，此处可能是由于燕麦β-葡聚糖上的结合位点逐渐饱和导致的。EGCG结合量的变化，如图2C所示，随着pH的增大EGCG的结合量逐渐减小，这是由于EGCG在中性和碱性pH条件下降解速度快，不稳定，在酸性pH下相对稳定[25]，因此随着pH升高，EGCG发生了解离[26]，使得其与BG间的作用力减弱，进而浊度下降，结合量减少。
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图 2 pH对EGCG-BG复合物形成的影响注：A：浊度；B：外观；C：EGCG结合量；D：粒径分布。Figure 2. Effect of pH on the formation of EGCG-BG complex除此之外，不同pH条件下EGCG-BG复合物的粒径及电位，如图2D和表2所示。粒径分布图（图2D）的结果表明：在pH为7时，EGCG-BG复合物包含粒径约为10~100 nm间的小颗粒群和100~1000 nm间的大颗粒群。在pH为5时，其仅有一组分布较窄，粒径在1000 nm左右的粒子。在pH3时，EGCG-BG复合物再次具有较明显的双峰分布，主峰在1000~10000 nm之间，次峰在100~1000 nm之间，这与粒径结果相符（表2），即随着pH降低复合物的粒径逐渐增大。复合物的形成和聚集随pH的变化归因于多酚上羟基电离状态的改变[15]，在低pH条件下，羟基被质子化，这使得EGCG和BG之间的氢键相互作用加强，从而形成更大的聚集体；随着pH升高EGCG开始发生解离，这时只有部分未解离羟基可与BG发生相互作用，同时，多酚的解离会使其在溶液中带负电产生静电斥力，这也会破坏BG与EGCG之间的相互作用，因此较高的pH会抑制复合物的形成，较低的pH会导致复合物的聚集沉淀，结合实验结果，EGCG-BG复合物在pH5左右时粒径相对均一且稳定。
表 2 不同pH下EGCG-BG复合物的平均粒径、多分散指数（PDI）和ζ-电位Table 2. Average particle size, polydispersity index (PDI) and ζ-potential of EGCG-BG complex at different pHpH 平均粒径（nm） PDI 平均电位（mV） 2 2756±191a 0.61±0.16b -3.82±0.36a 3 2011±157b 0.35±0.03c -5.12±0.78abc 4 1887±78c 0.40±0.05b -4.53±0.77ab 5 1769±58d 0.38±0.08c -6.67±0.07c 6 1595±106d 0.32±0.06c -6.05±0.07bc 7 283±12e 1.18±0.08a -5.21±1.02abc 2.2 复合物微观形貌
复合物的微观形貌通过透射电镜来表征，依据EGCG/BG质量比与pH的实验结果，选择pH5.0，EGCG与BG质量比为0.8的复合物进行微观形貌的观察，从图3可以看出，未添加EGCG的BG样品呈现纤维状的网络结构（图3A），这与Zielke等[27]的研究结果一致。而将EGCG与BG在pH5.0条件下且按照0.8:1的质量比混合后，两者发生了聚集，形成了粒径约为1.5~2.0 μm的近似球形颗粒状复合物（图3B），这与之前粒径的测定结果相一致，有部分颗粒粒径较大的原因可能是颗粒间粘附所导致的；同时可以看出，EGCG与BG间形成的颗粒形貌规整，且未见明显的BG纤维状结构，因此推认，在此质量比之下两者之间能够发生相互作用并形成球状复合物。
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图 3 BG及EGCG -BG复合物透射电镜图像注：A：BG；B：EGCG-BG。Figure 3. TEM images of BG and EGCG-BG complexes2.3 等温量热滴定分析
等温量热滴定法（ITC）是表征分子结合热力学的有力工具，已被用于确定多酚和大分子复合物的形成原理。它是通过测量分子缔合过程中产生的热量，来表征两个分子之间相互作用的一种方法[23]，近年来多用于探测多酚和大分子（例如蛋白质和多糖）之间非共价相互作用的热量变化[28]。Watrelot等[29-30]利用ITC分别研究了两种苹果原花青素与果胶之间相互作用的热量关系。为了进一步探究BG和EGCG之间的相互作用关系，利用等温量热滴定法（ITC）来研究两者作用过程的热量变化。
EGCG与BG间等温量热滴定的热量变化如图4所示，将EGCG滴入水中出现了一系列相对较小的吸热峰（图4A），这是由于EGCG滴入水中是一个稀释吸热反应；将EGCG滴入BG溶液中出现了一系列放热峰（图4B），放热峰的高度随着EGCG滴入次数的增加而减小，这可能是由于BG分子上的结合位点数量在逐渐饱和。EGCG分别滴入水中和BG溶液中时滴定曲线的差异表明EGCG和BG之间存在相互作用。
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图 4 EGCG滴定BG的等温滴定曲线注：A：EGCG滴定超纯水；B：EGCG滴定BG；C：热力学参数。Figure 4. Isothermal titration curve for the titration of EGCG with BG通过对热流时间曲线计算得到EGCG与BG之间的相互作用焓变曲线，通过“one set of sites”模型确定热力学参数（图4C）。得到结果：EGCG与BG的结合位点数量为1.03，即约有1.03个EGCG分子与1个BG分子发生结合（燕麦β-葡聚糖的分子量采用高效凝胶渗透色谱法测定，其平均分子量为37446 g/mol）。结合常数Kd为6.7×103 M−1，表明BG与EGCG具有较好的亲和力[24]。BG与EGCG结合的焓变（ΔH）和ΔS分别为−2.61和6.4×10−2 kcal/mol，表明两者的相互作用是由焓、熵驱动的，即两者相互作用的过程中即存在氢键缔合又存在疏水相互作用[31]；利用van’t Hoff方程（ΔG=ΔH−TΔS，T=298K）计算EGCG与BG相互作用的吉布斯自由能（ΔG）为−21.9 kcal/mol，即ΔG<0，表明EGCG与BG两者之间的相互作用是自发进行的[32]且在相互作用过程中氢键和疏水相互作用起主导作用，在燕麦β-葡聚糖与单宁酸的相互作用过程中也发现了类似的结果[15]。
2.4 EGCG-BG复合物表征
2.4.1 傅立叶显微红外光谱分析
傅里叶变换红外光谱是用来研究分子相对振动或者转动引起的分子偶极矩的变化，可用来研究化合物的化学结构，表征不同分子间的相互作用[17]。EGCG-BG的红外光谱图如图5所示，BG在1003 cm −1附近的吸收是源于糖苷键C-O-C伸缩振动[33]，其在1643 cm−1处的吸收峰是由于BG中羰基的伸缩振动[34]；EGCG的主要特征峰为1724 cm−1处酯键C=O的伸缩振动，1616和1221 cm−1处苯环的C=C和C-O特征峰，这与Lee等[35]和Avadhani等[36]的研究结果相同。EGCG-BG复合物中出现了BG特有的甲基特征峰及EGCG特有的酯键基团特征峰以及苯环的骨架振动峰，这证明了两者之间存在着相互作用；同时EGCG-BG复合物在3413 cm−1处峰宽度与BG相比有所降低，这可能是由于多酚羟基与BG羟基形成氢键，使得游离羟基减少，这些都能证明EGCG与BG之间存在非共价相互作用。
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图 5 EGCG-BG的红外图谱注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。Figure 5. FTIR analysis of chemical structures of EGCG-BG complex2.4.2 X-射线衍射分析
X-射线衍射可以提供直接的结构信息并确定分子的无定形区域和晶型结构。图6显示了EGCG，BG和EGCG-BG复合物的 X 射线衍射图（XRD）。由图可知，EGCG在10°~35.6°范围内显示出多个强烈而尖锐的峰，表明其具有高度结晶性[37]。相比之下，BG的仅在2θ=19.48°处有一个宽峰，表明其无定形态，且结晶度小。如果两者没有发生复合或者相互作用，那么在XRD衍射图谱中应该出现两个独立的分别对应BG和EGCG的衍射峰，然而在EGCG-BG复合物的XRD衍射图谱中22.29°处出现了新的衍射峰，这表明EGCG与BG两者间发生了相互作用，分子间相互作用的存在破坏了EGCG与BG原始的结晶区域导致两者原有的结构被破坏, 两者形成复合物后结构发生了重排。
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图 6 EGCG-BG的 X-射线衍射图谱注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。Figure 6. X-ray diffractograms （XRD） for EGCG-BG complex2.4.3 差示扫描量热分析
差示扫描量热分析（DSC）是一种通过物质热性能证明复合物形成的方法。由图7可看出，EGCG和BG分别在144.5和121.3 ℃出现了一个宽的吸热峰，这表明两种物质之间持水性（aw）的差异[38]，即该吸热过程发生在与水分含量和水分蒸发有关的结合水损失的过程。在EGCG-BG复合物中，EGCG与BG的吸热峰均消失，复合物的吸热峰往更低的温度方向移动（108.0 ℃），这是因为EGCG和BG形成了新的链间键，表明两者之间能够发生相互作用生成复合物而非混合物。这与Zhang等[39]的研究结果一致。
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图 7 EGCG-BG的示差扫描量热图注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。Figure 7. DSC analysis of EGCG-BG complex3. 结论
本文以表没食子酸儿茶素没食子酸酯与燕麦β-葡聚糖为原料，采用自发结合的方式成功制备了具有球形形态的EGCG-BG复合物，同时探究了不同质量比和pH对EGCG-BG混合溶液浊度、外观、粒径及结合量的影响，结果表明：复合物的形成与多酚的浓度有关，在EGCG/BG质量比为0.8时，两者组装形成的复合物粒子相对均一；同时pH对EGCG与BG的相互作用也会产生影响，中性pH条件下，EGCG-BG复合物会因EGCG的解离致使两者间相互作用减弱；但在酸性pH下，两者相互作用力较强，复合物易发生聚集和沉淀。ITC的实验结果证实了EGCG与BG之间的相互作用是能够自发进行的，而显微红外、XRD图谱和DSC的结果表明两者之间发生了非共价结合。本研究中形成的多酚-燕麦β-葡聚糖复合物可应用于食品体系，能够为研究多酚与食品基质间相互作用机制及富含膳食纤维和多酚营养型食品的设计提供理论参考。
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图 1 不同质量比对EGCG-BG复合物形成的影响
注：A：浊度；B：外观；C：EGCG结合量；D：粒径分布。
Figure 1. Effect of different mass ratios on the formation of EGCG-BG complex
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图 2 pH对EGCG-BG复合物形成的影响
注：A：浊度；B：外观；C：EGCG结合量；D：粒径分布。
Figure 2. Effect of pH on the formation of EGCG-BG complex
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图 3 BG及EGCG -BG复合物透射电镜图像
注：A：BG；B：EGCG-BG。
Figure 3. TEM images of BG and EGCG-BG complexes
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图 4 EGCG滴定BG的等温滴定曲线
注：A：EGCG滴定超纯水；B：EGCG滴定BG；C：热力学参数。
Figure 4. Isothermal titration curve for the titration of EGCG with BG
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图 5 EGCG-BG的红外图谱
注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。
Figure 5. FTIR analysis of chemical structures of EGCG-BG complex
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图 6 EGCG-BG的 X-射线衍射图谱
注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。
Figure 6. X-ray diffractograms （XRD） for EGCG-BG complex
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图 7 EGCG-BG的示差扫描量热图
注：a：EGCG-BG复合物；b：EGCG；c：BG。
Figure 7. DSC analysis of EGCG-BG complex
表 1 不同质量比下EGCG-BG复合物的平均粒径、多分散指数（PDI）和ζ-电位
Table 1 Average particle size, polydispersity index (PDI) and ζ-potential of EGCG-BG complex at different mass ratios
EGCG/BG（w/w） 平均粒径（nm） PDI 平均电位（mV） 0.1 344±16e 1.30±0.10a -6.41±0.03cd 0.2 403±37de 1.06±0.26abc -6.40±0.60cd 0.3 410±30de 1.09±0.13abc -6.81±0.14d 0.4 365±30de 0.94±0.3bcd -5.54±0.58abc 0.5 345±18e 1.16±0.07ab -5.54±0.73abc 0.6 334±22e 1.23±0.07ab -6.06±0.05bcd 0.7 443±22d 0.82±0.12cde -6.34±0.46bcd 0.8 1585±40c 0.51±0.02e -4.90±0.01a 0.9 1742±70b 0.81±0.06cde -5.28±0.15ab 1.0 1912±94a 0.72±0.07de -5.93±0.39bcd 注：同一列不同小写字母表示具有显著性差异（P<0.05）；表2同。 
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表 2 不同pH下EGCG-BG复合物的平均粒径、多分散指数（PDI）和ζ-电位
Table 2 Average particle size, polydispersity index (PDI) and ζ-potential of EGCG-BG complex at different pH
pH 平均粒径（nm） PDI 平均电位（mV） 2 2756±191a 0.61±0.16b -3.82±0.36a 3 2011±157b 0.35±0.03c -5.12±0.78abc 4 1887±78c 0.40±0.05b -4.53±0.77ab 5 1769±58d 0.38±0.08c -6.67±0.07c 6 1595±106d 0.32±0.06c -6.05±0.07bc 7 283±12e 1.18±0.08a -5.21±1.02abc
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