The Relationship between Reactive Oxygen Species and Bacillus cereus Biofilms Formation
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摘要: 为阐明活性氧（ROS）与蜡样芽孢杆菌菌膜形成的相关性，以市售原料奶中分离的蜡样芽孢杆菌分离株为目标菌，以细菌中NADPH氧化酶介导产生的ROS为主要靶点，用外源ROS补充剂过氧化氢(H2O2)、ROS清除试剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NADPH氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（DPI）处理蜡样芽孢杆菌，测定分析ROS变化与菌膜形成之间的关系。结果表明，0.01 μmol/L H2O2、1 μmol/L H2O2、100 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05），0.1 μmol/L H2O2、10 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量与对照组平均菌膜形成量相比无显著性差异（P>0.05），随着H2O2浓度的升高，ROS逐渐下降。NAC各处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05），随着NAC浓度的升高，ROS逐渐下降。DPI浓度≤1 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05），ROS逐渐下降；DPI浓度>5 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量显著低于对照组平均菌膜形成量（P<0.05），ROS含量升高。表明在不影响蜡样芽孢杆菌生长和细胞活性的前提下，一定浓度的H2O2、NAC和DPI处理菌株能够诱导ROS减少，增强蜡样芽孢杆菌菌膜的形成。激光共聚焦显微镜结果显示，与对照组相比处理组具有更强的染色效果，呈现红色的网络结构，而未经处理组呈现松散的结构和更少的菌膜生物量，这表明ROS对蜡样芽孢杆菌菌膜的形成存在抑制作用。Abstract: In order to clarify the correlation between reactive oxygen species (ROS) and Bacillus cereus biofilms, the ROS mediated by NADPH oxidase in the Bacillus cereus that were isolated from commercially available raw milk was used as the main target. The relationship between the formation of Bacillus cereus biofilms and ROS were analyzed by using supplement hydrogen peroxide (H2O2) as exogenous reactive oxygen species (ROS), N-acetylcysteine (NAC) as ROS scavenging agent and diphenyl iodide chloride (DPI) as NADPH oxidase inhibitor. The results showed that the treatment groups of 0.01 μmol/L H2O2, 1 μmol/L H2O2 and 100 μmol/L H2O2 average biofilms were higher than the control group average biofilms (P<0.05). There was no significant difference between the treatment groups of 0.1 μmol/L H2O2 and 10 μmol/L H2O2 and the control group average biofilms (P>0.05). With the increase of H2O2 concentration, ROS gradually decreased. The treatment groups of NAC average biofilms were higher than the control group average biofilms (P<0.05). ROS decreased gradually with the increase of NAC concentration. When DPI concentration≤1 μmol/L, with the increase of DPI concentration, the average biofilms were higher than the control group average biofilms (P<0.05), and ROS gradually decreased. When DPI concentration>5 μmol/L, with the increase of DPI concentration, the average biofilms were lower than the control group average biofilms (P<0.05), and the ROS increased. The results showed that without affecting the growth and activity of Bacillus cereus, the reduction of ROS induced by certain concentration of H2O2, NAC and DPI enhanced the Bacillus cereus biofilms. Confocal laser scanning microscopy showed stronger staining and red network structures in the treated groups compared to the control groups, while the untreated groups showed loose structures and fewer biofilms, suggesting that ROS inhibits the formation of Bacillus cereus biofilms.
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蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的革兰氏阳性食源性病原体，广泛分布于各种环境中，并形成耐酸、耐热和耐干燥的孢子[1]。该病原菌会引起全身感染和食物中毒，如腹泻、呕吐、脑膜炎、败血症、眼内炎和牙周炎等[2]。Bacillus cereus经常在生鲜乳及加工乳中被发现且可以附着在加工机械的表面，如阀门、管道和泵等，甚至形成菌膜，菌膜中的病原体对机械作用或常用消毒剂具有较强的抵抗力，会带来严重的健康风险，人体大约80%的细菌感染与菌膜有关[3]。在乳品加工线上形成的Bacillus cereus菌膜会增加该菌反复污染的风险，降低乳制品的质量，导致食品腐败从而引起食品安全问题[4]，对乳制品行业造成极大的威胁[5]。如何彻底消除乳品环境中的菌膜已成为一大挑战[6]，为此，了解Bacillus cereus菌膜的形成至关重要，制定合理的方案以消除乳品加工业中Bacillus cereus菌膜的污染问题。
目前，关于Bacillus cereus菌膜形成的研究主要集中在内部因素和外部因素两个方面，内部因素如Sin R[7]、Cod Y[8]、Sigma54（RpoN）[9]基因编码的蛋白质被认为参与Bacillus cereus菌膜的形成，外部因素包括酸碱度、温度、营养成分和细菌特性等[10-11]。CORCIONIVOSCHI等[12]通过对细菌Noxs研究综合分析后（Noxs是可以专一催化产生活性氧（ROS）酶类）提出，Noxs介导产生的ROS可能是细菌的一种重要信号分子，ROS可能参与食源性致病菌菌膜的形成，细菌菌膜形成中通常会伴随ROS的产生，但其对菌膜形成的影响尚无定论，如SHIVAPRASAD等[13]研究发现维生素C通过产生ROS使大肠杆菌（Escherichia coli）EMC17菌株氧化应激抑制其菌膜形成，菌膜基因表达下调；SUO等[14]研究发现超氧化物歧化酶缺失的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）突变体中ROS生成量升高，菌膜形成能力显著下降；WHITE等[15]研究发现过氧化氢酶（katA）基因破坏的奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）ROS水平增加，菌膜生物量减少，但KULKARNI等[16]发现香烟烟雾（ROS存在）下增加金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成；VILLA等[17]指出持续的外源ROS处理增加棕色固氮杆菌（Azotobacter vinelandii）野生型菌株（UW136）菌膜形成。WANG等[18]研究发现Bacillus cereus（ATCC14579）在黄素腺嘌呤二核苷酸刺激下增大Nox2转化率，证实Bacillus cereus中存在Noxs活性，活性部位存在于细胞膜上，因此，ROS与Bacillus cereus菌膜的形成和基因调控相关，但ROS在Bacillus cereus代谢或菌膜形成中的确切作用仍不清楚，且多数研究中的菌株并非来源于食品分离菌株，菌株差异性导致研究结果对实际指导的意义有限。
本文以新疆乌鲁木齐夏秋两季市售原料奶中Bacillus cereus分离株为研究目标，通过外源H2O2、N-乙酰半胱氨酸（NAC）ROS清除剂、二苯基氯化碘（DPI）NADPH氧化酶抑制剂处理Bacillus cereus，探讨ROS与Bacillus cereus菌膜形成之间的关系，为后期食品加工、运输过程中Bacillus cereus菌膜污染的有效控制奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） 菌株N2、N6，菌株Y10、Y22、Y34，菌株L6、L8、L9、L12、L24根据国标（GB4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验）分别从新疆乌鲁木齐零市售新鲜牛乳、羊乳及驴乳分离筛选，菌株甘油管冻存于−80 ℃冰箱备用。Bacillus cereus（CMCC63303）（BC） 上海理工大学医疗器械与食品学院微生物实验室；营养琼脂培养基、LB肉汤培养基 北京陆桥生物技术有限公司；0.1%结晶紫 分析纯，广东光华科技股份有限公司；NAC（N-乙酰半胱氨酸） 上海源叶生物科技有限公司；碘化丙啶（PI）试剂、二苯基氯化碘盐（DPI） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴化物（MTT） 贝奥替米生物技术公司（中国上海）；95%乙醇 成都市科隆化学品有限公司；过氧化氢（H2O2）、2.7二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO） 天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；Tu-1810APC分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；LE2002E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZX-50KBS型高压灭菌锅 上海早安医疗器械厂产品；THZ-98AB恒温培养振荡箱、DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MX-E涡旋振荡器 大龙兴创实验仪器北京有限公司；PHS-3C数显台式酸度计 上海浦春计量仪器有限公司；Tecan多功能酶标仪（Spark） 奥地利Tecan Austria GmbH公司；生物激光共聚焦显微镜（TCS SP8） 德国徕卡公司。
1.2 实验方法
1.2.1 奶源Bacillus cereus菌株的活化培养
将甘油管冻存的Bacillus cereus菌株进行活化，以0.1%接种量分别接入10 mL LB液体培养基，30 ℃、150 r/min条件下培养18 h后，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600为0.3，于4 ℃冰箱中贮存备用。
1.2.2 细菌活力及细胞活性测定
将OD600为0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔细胞培养板每孔100 μL，30 ℃培养24 h后测量细菌浓度（OD600）为细菌活力值，然后向每孔添加20 μL 0.5 mg/mL MTT密封后30 ℃反应4 h离心（4000 r/min，10 min）弃上层液体，再向每孔加150 μL二甲亚砜（DMSO），震荡溶解蓝色结晶，在570 nm波长下测量各孔光密度，以所有菌株细胞活性（MTT）均值绘图。
1.2.3 菌膜测定
采用96孔结晶紫染色法[19]测定菌膜含量，将OD600为0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔细胞培养板，每孔100 μL，平行接种5个孔，以相同条件的无菌LB液体培养基作为阴性对照，30 ℃下培养24 h后移除菌液，用无菌蒸馏水洗涤3次，室温静置30 min，然后向每孔中加入100 μL 0.1%结晶紫溶液，染色30 min后弃去结晶紫溶液，用无菌蒸馏水洗涤3次并室温静置干燥，再向每孔加入110 μL 95%乙醇溶液，脱色45 min后用酶标仪测定570 nm波长下吸光值，根据OD570值的大小衡量菌膜的形成量，分别进行3次独立重复试验。按照STEPANOVIC等[20]的菌膜划分标准，以空白对照（空白孔）平均吸光值加上3倍标准差为界定值（ODc），将菌株的菌膜形成能力划分为4个等级：OD570≤ODc，菌膜阴性；ODc<OD570≤2ODc，菌膜形成能力较弱；2ODc<OD570≤4ODc，菌膜形成能力中等；4ODc<OD570，菌膜形成能力较强。
1.2.4 ROS测定
采用DCFH-DA（2，7二氯荧光素二乙酸酯）法进行ROS测量[19]，向形成菌膜的96孔板中加入10 μmol/L的DCFH-DA，30 ℃避光培养30 min后用酶标仪检测每孔的荧光值（激发光波长488 nm，发射光波长530 nm），以所有菌株ROS的均值绘图。
1.2.5 H2O2对Bacillus cereus菌膜形成的影响
将H2O2加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使H2O2终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。
1.2.6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）对Bacillus cereus菌膜形成的影响
将NAC加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使NAC终浓度为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。
1.2.7 二苯基氯化碘盐（DPI）对Bacillus cereus菌膜形成的影响
将DPI加入OD600为0.3的Bacillus cereus菌液中，使DPI终浓度为0、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，混匀后，分别取100 μL加入96孔细胞培养板中，设5个平行，密封后静置于30 ℃培养箱，24 h后培养后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4进行细菌活力及细胞活性测定、菌膜测定、ROS测定。
1.2.8 激光共聚焦显微镜测定菌膜形成
将1 mL OD600为0.3的Bacillus cereus（CMCC63303）菌液接入12孔细胞培养板中作为对照组，分别添加终浓度为0.01、0.1、1、10、100 μmol/L H2O2，终浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L NAC，终浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L DPI为处理组，置于30 ℃培养箱，24 h培养后用无菌蒸馏水洗涤3次，室温静置45 min后用碘化丙啶（PI）荧光染液封片，然后用激光共聚焦显微镜观察菌膜形成。
1.3 数据处理
实验重复三次，采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序对数据进行统计分析，采用Dun检验进行多重比较确定差异显著性，应用Excel 2016和Adobe illustrator 2020制作图表。
2. 结果与分析
2.1 H2O2对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响
由图1可知，随着H2O2浓度的升高，细菌活力逐渐下降，所有H2O2处理组（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05）。由图1细胞活性变化趋势可知，当H2O2浓度≥1 μmol/L时，Bacillus cereus细胞活性显著高于H2O2低浓度处理组（0.01、0.1 μmol/L）细胞活性（P<0.05），表明较高浓度的H2O2对细胞活性有一定的促进作用。
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由图2可知，0.01、1、100 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量均高于对照组平均水平（P<0.05）。0.01 μmol/L H2O2处理时，Y10、Y22、Y34菌株形成较强菌膜，BC、N6、L9、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8菌株形成较弱菌膜；1 μmol/L H2O2处理时，BC、N2、N6、Y10、L24菌株形成较强菌膜，Y22、Y34、L6、L9、L12菌株形成中等菌膜，L8菌株形成较弱菌膜；100 μmol/L H2O2处理时，BC、N2、N6、Y10、Y22、Y34、L8、L12、L24菌株形成较强菌膜，L6、L9形成中等菌膜。
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图 2 不同H2O2浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Figure 2. Effect of different H2O2 concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus由图2可知，0.1、10 μmol/L H2O2处理组平均菌膜形成量与对照组平均菌膜水平无显著性差异（P>0.05）。0.1 μmol/L H2O2处理时，BC、N6、Y10、Y22、Y34、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8、L9形成较弱菌膜；10 μmol/L H2O2处理时，BC、Y10、Y22、Y34、L24菌株形成中等菌膜，N2、N6、L6、L8、L9、L12菌株形成较弱菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成较弱菌膜。可见部分浓度H2O2处理促进Bacillus cereus菌膜形成。
由图2 ROS变化趋势可知，随着H2O2浓度的升高，ROS逐渐下降。尽管外源补充H2O2但ROS水平并未提高，这可能是因为Bacillus cereus对这种外源氧化压力作出应答且菌体本身也在不断产生和消耗ROS，因此，即使外源补充100 μmol/L H2O2，ROS含量仍呈下降趋势。这与REDER等[21]的研究发现一致，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌膜相关基因突变株经百草枯和H2O2等超氧化物生成剂处理后ROS含量显著减少（P<0.05）。结果表明：伴随着ROS含量的降低，Bacillus cereus菌膜形成量增强，因此，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。
2.2 NAC对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响
由图3可知，与对照组相比，NAC各处理组Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05），各处理组间细菌活力无显著差异（P>0.05）。NAC 各处理组细胞活性与对照组相比无显著性差异（P>0.05），表明NAC处理浓度对Bacillus cereus的生长和细胞活性的影响不大。这与GUO等[22]研究发现NAC处理组浓度对单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的生长和生存能力没有影响的结果一致。
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图 3 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响Figure 3. Effect of different NAC concentration on vigor and viability of Bacillus cereus由图4可知，NAC各处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）。各处理组间相比，0.0001 mmol/L NAC处理组及0.001 mmol/L NAC处理组平均菌膜形成量最高，0.01 mmol/L NAC处理组平均菌膜形成量最低。
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图 4 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Figure 4. Effect of different NAC concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus当0.0001 mmol/L NAC处理时，Y22、Y34菌株形成较强菌膜；0.001 mmol/L NAC处理时，N6、Y22、L12菌株形成较强菌膜；0.1 mmol/L NAC处理时，Y22菌株形成较强菌膜；1 mmol/L NAC处理时，Y10菌株形成较强菌膜；0.01 mmol/L NAC处理时，L9、L24菌株形成较弱菌膜，其他9株菌均形成中等菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成较弱菌膜。
由图4 可知，随NAC浓度的升高，ROS逐渐下降。这是因为NAC是ROS的清除剂，随着NAC浓度的增大，ROS含量逐渐减小，但Bacillus cereus菌膜形成量增大。这与GUERINI等[23]研究发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌膜随NAC浓度（0.5~4.0 mg/mL）增加而增加的结果一致。结果表明，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。
2.3 DPI对Bacillus cereus生长及菌膜形成的影响
由图5可知，随着DPI浓度的升高，细菌活力逐渐下降，所有DPI处理组（0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）Bacillus cereus活力显著低于对照组细菌活力（P<0.05）。由图5细胞活性变化趋势知，随着DPI浓度的升高，细胞活性也逐渐减弱，当DPI浓度大于1 μmol/L时，Bacillus cereus细胞活性显著低于对照组（P<0.05）但仍有细胞活性。
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图 5 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响Figure 5. Effect of different DPI concentration on vigor and viability of Bacillus cereus由图6可知，当DPI浓度≤1 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量均高于对照组平均菌膜水平（P<0.05）。其中，0.1 μmol/L DPI处理组及1 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量最高，显著高于0.05 μmol/L DPI处理组及0.5 μmol/L DPI平均菌膜形成量（P<0.05）。0.1 μmol/L DPI处理时，N6、L9、L12菌株形成较强菌膜；1 μmol/L DPI处理时，N6菌株形成较强菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.05 μmol/L DPI处理时，Y34菌株形成较弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.5 μmol/L DPI处理时，BC、Y34、L24菌株形成较弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜。
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图 6 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响Figure 6. Effect of different DPI concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus当DPI浓度>5 μmol/L 时，随着DPI浓度的升高，平均菌膜形成量低于对照组平均菌膜水平（P<0.05）。5 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量显著高于10 μmol/L DPI处理组平均菌膜形成量（P<0.05）。5 μmol/L DPI处理时， N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成较弱菌膜；10 μmol/L DPI处理时，N6、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成较弱菌膜；对照组N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株BC、Y22、Y34、L6、L8、L24形成较弱菌膜。
由图6 ROS变化趋势可知，随着DPI浓度的升高，ROS的产生水平呈U型趋势。这是因为DPI是一种NADPH氧化酶抑制剂，抑制ROS产生，当DPI浓度≤1 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，ROS逐渐下降；当DPI浓度>5 μmol/L时，随着DPI浓度的升高，ROS含量升高。结果表明：ROS产生和菌膜形成的趋势相反，即低浓度DPI处理伴随ROS的降低，Bacillus cereus菌膜形成量的增加，高浓度DPI处理伴随ROS含量的升高，Bacillus cereus菌膜形成量的减少，因此，Bacillus cereus菌膜形成与ROS的减少相关。
2.4 激光共聚焦显微镜测定菌膜形成
由图7A可知，0.01 μmol/L H2O2、1 μmol/L H2O2、100 μmol/L H2O2处理组与对照组相比具有更强的染色效果，菌膜呈现红色的网络结构，而未经处理组（对照组）呈现松散的结构和更少的菌膜生物量，与图2定量菌膜形成结果一致。由图7B可知，NAC各处理组与对照组相比具有更强的染色，各处理组菌膜呈现红色的网络结构，而对照组显示松散的结构和较少的菌膜生物量，与图4定量菌膜形成结果一致。由图7C可知，低浓度各处理组（DPI≤1 μmol/L）与对照相比具有更亮的染色，呈现红色的网络结构，高浓度处理组（DPI>5 μmol/L）随着DPI浓度的升高，红色信号越来越弱，当10 μmol/L DPI浓度处理时，视野中红色信号极少，表明低浓度的DPI处理对Bacillus cereus菌膜形成起促进作用，高浓度DPI处理对Bacillus cereus菌膜形成起抑制作用，与图6定量菌膜形成结果一致。因此，综合以上结果，本研究得到Bacillus cereus菌膜形成与ROS减少相关的结论，这与HAJ等[24]发现金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成依赖于ROS诱导量减少有关的研究结果一致。
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图 7 共聚焦显微镜下观察不同浓度（H2O2、NAC、DPI）对蜡样芽孢杆菌菌膜形成的影响注：A：H2O2；B：NAC；C：DPI。Figure 7. Effect of different concentrations (H2O2, NAC, DPI) on the formation of Bacillus cereus biofilms observed under confocal microscope3. 结论与讨论
ROS包括羟基自由基（OH）、原子氧（O）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）和臭氧（O3）等，ROS的累积超过允许水平会对各种大分子（DNA、蛋白质和脂质）造成损害，最终导致细胞死亡[25]，ROS在生物体中的作用不是单一的、绝对的，细菌往往会通过某些途径主动生成较低水平的ROS，这些ROS在细菌中起到信号或是调节的作用，激发细菌某些特殊机制，如进入防御状态、辅助细菌入侵宿主细胞、抑制环境中其他竞争者等[26]。CAP等[27]研究发现一定水平的ROS诱导会保护机体免受压力机制，引起菌体对压力适应性反应，ROS可能是作为诱导细菌群落分化和信号传递的信号分子，ROS诱导遗传变异促进特定菌膜区域的细胞死亡，以部分细胞的死亡增加同一群体中其他细胞的存活。
因此，ROS作为一种信号分子，探究其在细菌及其菌膜形成中的具体作用，有利于研发新型高效的抑菌剂和杀菌剂。本研究从不同奶源Bacillus cereus分离株的菌膜形成分析入手，以一定浓度的H2O2、NAC、DPI处理待测菌株，采用96孔结晶紫定量测定及激光共聚焦显微镜观察菌膜形成情况，实验中测试了细菌细胞活力，以排除试剂对细菌活性的影响，发现ROS是Bacillus cereus菌膜形成的潜在信号分子，随着ROS的减少，Bacillus cereus菌膜形成量增加。在未来的研究中，还需进一步剖析外源ROS和内源ROS在调节菌膜形成中是否发挥不同的作用，并检测可疑NADPH氧化酶的敲除和过表达是否改变Bacillus cereus的ROS产生和菌膜形成，这将有助于理解Bacillus cereus与ROS相关的菌膜形成机制。
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图 2 不同H2O2浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响
Figure 2. Effect of different H2O2 concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus
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图 3 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响
Figure 3. Effect of different NAC concentration on vigor and viability of Bacillus cereus
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图 4 不同NAC浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响
Figure 4. Effect of different NAC concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus
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图 5 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌活力和细胞活力的影响
Figure 5. Effect of different DPI concentration on vigor and viability of Bacillus cereus
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图 6 不同DPI浓度对蜡样芽孢杆菌ROS产生及菌膜形成的影响
Figure 6. Effect of different DPI concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus
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