Extraction, Purification, Identification of A-type Procyanidine from Litchi Fruitlet and Its Antioxidant Activity
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摘要: 本文以荔枝生理落果为原料，采用乙醇提取、AB-8大孔树脂纯化和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶分离得到多酚组分，采用DPPH·、ABTS+·清除法及FRAP法测定各多酚组分体外抗氧化活性后，使用电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱（LC-ESI-Q-TOF）对多酚进行鉴定。结果表明，荔枝生理落果总酚及总原花青素含量分别为（49.96±2.66）mg GAE/g DW和（27.25±0.44）mg EPE/g DW；而体外抗氧化活性结果表明，第4个多酚组分（P4）具有较强ABTS+·和DPPH·清除能力，当100 μg/mL时，清除率分别为92.52%和46.98%，总抗氧化能力显著高于抗坏血酸（P<0.05）；经LC-ESI-Q-TOF分析发现，荔枝生理落果多酚纯化物含有10种A型原花青素，其中P4组分由纯A型原花青素组成，分别为原花青素A4、原花青素A2及A型原花青素二聚体和四聚体。从荔枝生理落果中分离纯化的A型原花青素具有优秀的抗氧化活性，可作为新的A型原花青素来源。Abstract: In this study, polyphenol fractions were extracted from litchi fruitlet which drop naturally, then purified by AB-8 macroporous resin and separated by Sephadex LH-20. After comparing the antioxidant activities of each sample in vitro, the polyphenol components were identified by LC-ESI-Q-TOF. The results showed that the content of total phenols and total procyanidines in litchi fruitlet were (49.96±2.66) mg GAE/g DW and (27.25±0.44) mg EPE/g DW, respectively. In vitro antioxidant activity text indicated that the fourth polyphenol component (P4) had strong ABTS+· and DPPH· scavenging ability, and its free radical scavenging rate could reach 92.52% and 46.98% in 100 μg/mL respectively. According to LC-ESI-Q-TOF analysis, PLFE contained 10 types of A procyanidines, which were much more than B procyanidines. P4 was composed of pure A-type procyanidine, which were procyanidine A4, procyanidine A2, A-type procyanidine dimer and tetramer. Therefore, A-type procyanidine isolated and purified from litchi fruitlet have remarkable antioxidant activity, which can be used as an excellent source of new A-type procyanidine.
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荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是一种产于东南热带到亚热带的作物，为常绿乔木植物的果实，属无患子科荔枝属[1-2]。研究发现，荔枝多酚在荔枝果皮、果肉和果核中都有分布，其中果皮中含量最高，是荔枝中主要功能性成分之一[3-4]。大量研究表明，荔枝多酚具有多种生物活性，如抗氧化、抗癌、降血糖等[5-9]。而原花青素是由黄烷3醇单体构成的多酚化合物，根据不同连接键可分为A型原花青素（C-O-C）及B型原花青素（C-C），根据分子量大小又可分为单体、低聚体和高聚体，广泛分布于各种植物的皮和核[10-11]。在植物中，A型原花青素远不如B型原花青素常见，荔枝则是少数以A型原花青素为主的植物之一[12]。同时，荔枝自开花结果到成熟过程中，因品种、气象条件等因素，会有3~4次的落果高峰[13]。为了提高荔枝的产量和品质，人们会进行人工疏果，获得大量的小果实。而这些荔枝生理落果不可食用，应用范围较窄，常作为农业废弃物丢弃。KAUR等[14]研究发现，荔枝从坐果到成熟过程中原花青素含量呈下降趋势，因此荔枝生理落果可作为原花青素的良好来源之一。如今，荔枝中已被鉴定出含有12种二聚体及6种三聚体，其中原花青素A1、原花青素A2及表儿茶素-（4β→8,2β→O→7）-表儿茶素-（4β→8）-表儿茶素等A型低聚原花青素结构已明晰，但随着聚合度的增加，同分异构体数量也随之增加，增加了对聚合度在3以上的原花青素结构的鉴定难度[15-16]。同时，A型低聚原花青素也通过动物实验进一步明确了其抗动脉粥样硬化及抗糖尿病等生物活性[17-18]。
目前，对荔枝生理落果的研究主要集中在果实自然脱落的预防及机制和生长过程中一些基本成分的变化，尚未见有研究对荔枝生理落果中生物活性成分进行提取鉴定并发掘其潜在的利用价值。为深入探究荔枝生理落果中酚类化合物的组成并寻找具有活性的多酚组分，本文用乙醇作为提取溶剂对荔枝生理落果中酚类物质进行提取，采用大孔树脂及葡聚糖凝胶对提取物进行分离纯化，采用体外抗氧化对不同的多酚组分进行评价，并利用HPLC及LC-Q-TOF对多酚组分进行物质鉴定，以期为荔枝生理落果的废物利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
2020年新鲜荔枝落果（品种：白糖罂） 取自茂名当地果园，整果经40 ℃热风干燥54 h，打粉后储存于干燥皿中备用；AB-8大孔树脂、Sephadex LH-20、福林酚（分析纯）、没食子酸（标准品）、表儿茶素（标准品）、原花青素A2（标准品）、原花青素A4（标准品）、芦丁（标准品） 上海源叶生物科技有限公司；香草醛（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；甲酸（色谱纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 德国默克公司。
Lab-1C-50型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；1260 Infinity型高效液相色谱仪型、Agilent6540UHD Q-TOF，Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×250 mm 5-Micron） 安捷伦科技有限公司；Uvmini-1240型紫外分光光度计 日本岛津公司；TD5-II低速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；H01-1D恒温磁力搅拌器 梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 荔枝生理落果粗多酚化合物提取
参考LI等[15]的方法并稍作修改。荔枝生理落果粉末用正己烷按1:10（mg/mL）的料液比混合后静置过夜，3500 r/min离心15 min除去正己烷后，按1:10（mg/mL）的料液比与70%乙醇混合后在室温下300 r/min磁力搅拌提取，重复提取至溶液基本无色，合并提取液，浓缩后冻干为荔枝生理落果多酚粗提物（Litchi Fruitlet Extract，LFE），测定提取液及LFE中多酚及原花青素含量。
1.2.2 AB-8大孔树脂纯化
参考LI等[15]的方法并稍作修改。LFE溶解后上样AB-8大孔树脂柱（2.5 cm×60 cm），随后用蒸馏水洗去糖和蛋白质，再用乙醇洗脱吸附的多酚，分管收集（10 mL/管），每管测定多酚含量，根据洗脱曲线合并洗脱液，冻干得荔枝生理落果多酚纯化物（Purity Litchi Fruitlet Extract，PLFE），测定多酚及原花青素含量。
1.2.3 Sephadex LH-20葡聚糖凝胶分离
参考ZHOU等[19]的方法并稍作修改。PLFE配制成高浓度的多酚溶液（50 mg/mL），采用20%、40%、60%、80%甲醇溶液进行梯度洗脱，洗脱液分管收集，每管10 mL，于280 nm处测定吸光值，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集不同组分，合并后于旋转蒸发仪40 ℃减压浓缩备用。
1.2.4 电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱（LC-ESI-Q-TOF）
参考何婷等[20]的方法并稍作修改。使用高效液相色谱（HPLC）系统分析酚类化合物，使用安捷伦Zorbox SB-C18柱，紫外分光光度检测器。进样量为10 μL，柱温维持在30 ℃，流速0.7 mL/min，检测波长280 nm。流动相为0.4%（v/v）甲酸水溶液（溶液A）和甲醇（溶液B）。洗脱条件如下：0~10 min（15%~35% B）；10~25 min（35%~45% B）；25~40 min（45%~60% B）；40~45 min（20% B）。
为进行物质鉴定，所选样品在Agilent 6540UHD Q-TOF进行ESI负离子分析上进行分析，流动相和洗脱条件与高效液相色谱分析相同。质谱使用ESI离子源收集条件：孔板电压−30 V；雾化压力45 Psi；热毛细管温度275 ℃；质量范围m/z 100~1200；干燥气为氮气。
根据LC-ESI-Q-TOF得到相应出峰时间物质的分子量、碎片离子峰，并通过与标准品保留时间的比较，对表儿茶素、原花青素及芦丁的峰进行定性分析，标准品包括表儿茶素、原花青素A2、原花青素A4、芦丁。
1.2.5 酚类物质含量及体外活性测定
1.2.5.1 总酚及总原花青素含量测定
参考RAN- GKADLLOK等[21]的方法对总酚含量进行测定。取0.1 mL稀释后的样品液于10 mL棕色容量瓶并加少量的水和0.5 mL福林酚溶液，摇匀完静置3~4 min，在8 min内加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至刻度，室温下避光反应2 h，在765 nm下测吸光值，以蒸馏水为空白，重复测定3次。以没食子酸为标准品所绘制的标准曲线为：
Y=0.0012X+0.0195，R2=0.9994 (1) 参考ZHANG等[22]的方法对总原花青素含量进行测定。取1 mL稀释后的样品液与2.5 mL 1%（w/v）香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 20% （v/v） H2SO4-甲醇溶液混合。溶液在30℃的条件下避光水浴反应20 min。测定样品在500 nm处的吸光度，以甲醇为空白，重复测定3次。以表儿茶素为标准品所绘制的标准曲线为：
Y=0.0057X+0.0188，R2=0.9994 (2) 测定结果根据如下公式计算荔枝生理落果及提取物（LFE、PLFE）的总酚、总原花青素含量。
含量=mM×100 (3) 式中：m为计算所得总酚、原花青素的质量，mg；M为提取所用荔枝生理落果的质量或测定所用提取物（LFE、PLFE）的质量，mg。
1.2.5.2 体外抗氧化活性测定
以铁还原/抗氧化能力（FRAP）和清除DPPH·、ABTS+·活性评价其体外抗氧化活性，参考ZHOU等[19]的方法进行测定，并稍作改动。取0.1 mL样品液加3.9 mL 自由基反应液，避光反应，记为A1。两者均用95%乙醇代替样品液作为对照组，记为A0，以蒸馏水为空白参比，以抗坏血酸作为阳性对照，分别于517 nm和734 nm测吸光值。按以下公式计算自由基清除率，并计算IC50值。
自由基清除率(%)=A0−A1A0×100 (4) FRAP总抗氧化能力：取0.1 mL样品液与5 mL现配的FRAP试剂混合，避光37 ℃下水浴反应10 min，以蒸馏水为空白，以抗坏血酸为阳性对照，在593 nm处测定吸光值。将测量结果与Trolox标准曲线比较，将样品达到相同吸光度所需Trolox的毫摩尔数，用来表示其抗氧化活性（FRAP值）。
1.3 数据分析
采用Origin2018软件处理数据并作图，每个样品测定3个平行并所有实验均重复3次，通过SPSS 20.0软件对数据进行显著性分析（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 荔枝生理落果多酚提取、纯化结果
经测定，荔枝生理落果中总酚及总原花青素含量分别为（49.96±2.66）mg GAE/g DW和（27.25±0.44）mg EPE/g DW，提取液经浓缩冻干后得到LFE，其多酚含量为（202.46±1.94）mg/g，原花青素含量为（106.75±1.34）mg/g。有研究表明，成熟荔枝中多酚总量为264.36~662.51 mg/kg，原花青素总量为7.09~22.76 mg/g，并且荔枝中总酚含量高于菠萝、香蕉等4种热带水果，仅次于百香果，原花青素含量则远高于大部分市售水果[4,23-25]。可见荔枝生理落果富含多酚及原花青素，可作为新的酚类物质来源。
为提高LFE中酚类物质的纯度，将LFE上样大孔树脂AB-8进行动态吸附洗脱，洗脱曲线如图1所示，根据洗脱曲线合并第17~35管洗脱液，浓缩冻干得PLFE。经测定，纯化后PLFE多酚含量可达到（545.85±7.84）mg/g，原花青素含量可达到（205.92±3.224）mg/g。AB-8大孔树脂属于低极性树脂，可从溶剂中吸附小分子的低极性物质，常用于植物多酚的分离纯化[26]。由数据可见，经大孔树脂纯化后，LFE中大部分的糖和蛋白质等杂质被除去，并有效保留了大部分酚类物质于PLFE中。
为进一步对PLFE中复杂的酚类物质分离，将PLFE上样Sephadex LH-20凝胶色谱（1.6 cm×45 cm）。Sephadex LH-20分离植物成分的原理与分子排阻色谱原理相似，根据目标分离产物分子量的不同可达到进一步分离纯化的目的[27]。经不同浓度甲醇溶液洗脱，根据样品在280 nm下的吸光值，将样品分为P1、P2、P3和P4四个组分，洗脱曲线如图2所示。
2.2 不同组分多酚体外抗氧化活性及组成
2.2.1 体外抗氧化活性
荔枝果皮中含有大量的花青素和类黄酮，这些化合物能够通过螯合金属离子，形成金属配合物，直接清除超氧阴离子[28]。
P1~P4组分、PLFE及抗坏血酸对ABTS+·、DPPH·清除能力及总抗氧化能力如图3~5所示。由图可知各样品体外抗氧化活性均表现出剂量依赖性。P1~P4组分和PLFE的ABTS+·清除能力均显著高于抗坏血酸（P<0.05），其中P4组分自由基清除能力最强，其在100 μg/mL时ABTS+·清除能力是抗坏血酸的1.5倍。各样品DPPH·清除能力表现出与ABTS+·相似的趋势，P1~P3组分自由基清除能力较低，当浓度在20~60 μg/mL时，P4组分对DPPH·清除能力显著高于抗坏血酸（P<0.05），而PLFE则与抗坏血酸相当，而浓度在80~100 μg/mL时，P4组分自由基清除能力与抗坏血酸相似。各组分ABTS+·及DPPH·清除能力IC50值大小排序分别为：P4（38.21 μg/mL）>PLFE（47.03 μg/mL）>P2（55.11 μg/mL）>P3（56.90 μg/mL）>P1（57.17 μg/mL）>抗坏血酸（81.24 μg/mL）和抗坏血酸（100.73 μg/mL）>P4（102.50 μg/mL）>PLFE（111.70 μg/mL）>P3（144.98 μg/mL）>P2（166.85 μg/mL）>P1（285.29 μg/mL），两者趋势相似，说明P4组分能够有效清除自由基离子，具有较强的抗氧化活性。而在总抗氧化能力测定结果中，P1组分表现出最强的抗氧化活性，在高浓度下显著高于其他多酚样品及抗坏血酸（P<0.05），而P4和P2组分总抗氧化能力相当，在100 μg/mL时约是抗坏血酸的1.06倍。P3和PLFE抗氧化能力虽较弱，但也显著高于抗坏血酸（P<0.05）。
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图 3 各组分及抗坏血酸ABTS+·清除能力注：不同小写字母表示组内的显著性差异分析（P<0.05），字母由a~e代表数据从小到大；图4~图5同。Figure 3. ABTS+· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid![]()
图 4 各组分及抗坏血酸DPPH·清除能力Figure 4. DPPH· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid![]()
图 5 各组分及抗坏血酸总抗氧化能力Figure 5. Total antioxidant capacity of each component and ascorbic acid荔枝中富含多酚类物质，不同品种的荔枝及不同提取方式得到的产品其结构和活性均不相同。研究发现不同溶剂提取的荔枝果皮粗多酚活性弱于抗坏血酸，大孔树脂纯化后DPPH·清除能力与抗坏血酸相当，而进一步分离得到的多酚化合物抗氧化活性差别较大，个别显著强于抗坏血酸及对照丁基羟基甲苯（BHT）[9,29-31]。可见荔枝中的多酚类化合物具有一定的抗氧化活性，但由于多酚种类及结构上的不同，其抗氧化活性存在一定的差异。综合3个体外抗氧化测定结果考虑，P4组分表现出较强的抗氧化能力，说明通过AB-8大孔树脂及LH-20分离纯化后得到的P4组分中含有强抗氧化活性的物质。为进一步探究P4中的活性成分，对P4组分中多酚化合物组成进行LC-ESI-Q-TOF分析。
2.2.2 物质鉴定
图6为PLFE的HPLC图。为了进一步明确其物质组成，采用LC-Q-TOF进行ESI负离子分析，对其中主要的化合物进行鉴定。PLFE组成如表1所示，经质谱分析可鉴定出15种物质，除去编号10的芦丁外，其余均为原花青素的低聚物。其中编号6为表儿茶素，编号3-2、4、5-2、7-3、8、9为原花青素二聚体，编号1、2、3-1、5-1、5-3、7-1、7-2为原花青素三聚体。在原花青素的低聚物中，A型占了10种，B型仅有3种。这表明荔枝落果中原花青素多数以A型的低聚物形式存在。荔枝也已被证实是为数不多以A型原花青素为主的水果之一。LI等[32]通过LC-ESI-MS分析发现A型原花青素约占荔枝果皮低聚原花青素提取物41.7%，而B型约占24.1%。MA等[29]及GONG等[33]通过多重色谱分离方法从荔枝果皮中分离得到了原花青素A1、原花青素A2、表儿茶素及芦丁。MAN等[18]用乙醇提取荔枝核，D101大孔树脂纯化，经UPLC-MS鉴定出表儿茶素、原花青素A1及芦丁。刘梦等[34]将荔枝核乙醇提取物经多种色谱方法分离，得到15种化合物，其中也包含芦丁和原花青素A2。
表 1 PLFE多酚组成成分分析Table 1. The polyphenols composition analysis of PLFE编号 保留时间（min） 质荷比（m/z） 分子式 化合物名称 1 4.826 863.1834 C45H36O18 A型原花青素三聚体 2 7.796 863.1815 C45H36O18 A型原花青素三聚体 3-1 10.943 863.1834 C45H36O18 A型原花青素三聚体 3-2 10.943 575.1195 C30H24O12 A型原花青素二聚体 4 11.516 577.1356 C30H26O12 B型原花青素二聚体 5-1 12.313 865.1968 C45H38O18 B型原花青素三聚体 5-2 12.313 575.0647 C30H24O12 A型原花青素二聚体 5-3 12.313 863.1826 C45H36O18 A型原花青素三聚体 6 14.273 289.0725 C15H14O6 表儿茶素 7-1 16.743 863.1828 C45H36O18 A型原花青素三聚体 7-2 16.743 863.6838 C45H36O18 A型原花青素三聚体 7-3 16.743 575.1206 C30H24O12 A型原花青素二聚体 8 17.289 577.1358 C30H26O12 B型原花青素二聚体 9 19.099 575.1197 C30H24O12 A型原花青素二聚体 10 23.343 609.1475 C27H30O16 芦丁 图7为P4组分的HPLC图，P4多酚组成如表2所示，一共鉴定出4个物质，出峰时间主要集中在15~25 min，其中保留时间为16.102、20.122和23.959 min的物质经Q-TOF鉴定，其m/z均为575.1，其二级质谱包含449.0、423.0及285.03的碎片离子峰，符合A型原花青素二聚体的裂解途径[35]。而保留时间在20.122 min的另一个物质m/z为1151.2，其二级质谱包含575.1、423.0及285.0的碎片离子峰，说明该物质是含有一个C-O-C键连接的原花青素四聚体。经过与原花青素标准品进行内标和外标法对照，鉴定出保留时间在16.102 min和20.122 min的两个原花青素二聚体分别是原花青素A4和原花青素A2。已有研究表明从荔枝中提取分离出荔枝单宁A1、荔枝单宁A2、原花青素A2和A型三聚体均具有较强的自由基清除能力[32,36]。根据2.2体外抗氧化的数据结果，P4组分的DPPH·和ABTS+·清除能力均显著高于抗坏血酸（P<0.05），这与文献中的研究结果相似，说明A型原花青素具备很好的体外抗氧化特性。
表 2 P4组分多酚组成成分分析Table 2. The polyphenols composition analysis of P4编号 保留时间（min） 质荷比（m/z） 分子式 化合物名称 1 16.102 575.1203 C45H36O18 原花青素A4 2-1 20.122 575.1204 C45H36O18 原花青素A2 2-2 20.122 1151.2437 C60H48O24 A型原花青素四聚体 3 23.959 575.1197 C45H36O18 A型原花青素二聚体 由此可见，荔枝生理落果中富含A型原花青素，通过AB-8大孔树脂纯化、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶分离后可富集得到纯A型原花青素的提取物，具有作为A型原花青素优秀来源的潜力。
3. 结论
荔枝生理落果富含多酚及原花青素，含量分别为（49.96±2.66）mg GAE/g DW和（27.25±0.44）mg EPE/g DW；提取物经AB-8大孔树脂纯化，LH-20葡聚糖分离得到4个多酚组分，经对比体外抗氧化活性，P4组分具有较强的ABTS+·和DPPH·清除能力，在100 μg/mL时，清除率可分别达到92.52%和46.98%，总抗氧化能力显著高于抗坏血酸（P<0.05）；采用LC-ESI-Q-TOF对多酚组分鉴定发现，荔枝生理落果多酚纯化物中含有大量低聚原花青素，包含10种A型原花青素及3种B型原花青素，而P4组分主要由原花青素A4、原花青素A2及A型原花青素二聚体和四聚体组成。可见，荔枝生理落果中的A型原花青素具有优秀的生物活性，有进一步开发利用成保健品的潜力。而市售A型原花青素远没有B型原花青素普遍，来源较为单一，本文结果表明荔枝生理落果中富含大量A型原花青素，说明荔枝生理落果可作为一种新的A型原花青素植物原料。
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图 3 各组分及抗坏血酸ABTS+·清除能力
注：不同小写字母表示组内的显著性差异分析（P<0.05），字母由a~e代表数据从小到大；图4~图5同。
Figure 3. ABTS+· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid
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图 4 各组分及抗坏血酸DPPH·清除能力
Figure 4. DPPH· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid
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图 5 各组分及抗坏血酸总抗氧化能力
Figure 5. Total antioxidant capacity of each component and ascorbic acid
表 1 PLFE多酚组成成分分析
Table 1 The polyphenols composition analysis of PLFE
编号 保留时间（min） 质荷比（m/z） 分子式 化合物名称 1 4.826 863.1834 C45H36O18 A型原花青素三聚体 2 7.796 863.1815 C45H36O18 A型原花青素三聚体 3-1 10.943 863.1834 C45H36O18 A型原花青素三聚体 3-2 10.943 575.1195 C30H24O12 A型原花青素二聚体 4 11.516 577.1356 C30H26O12 B型原花青素二聚体 5-1 12.313 865.1968 C45H38O18 B型原花青素三聚体 5-2 12.313 575.0647 C30H24O12 A型原花青素二聚体 5-3 12.313 863.1826 C45H36O18 A型原花青素三聚体 6 14.273 289.0725 C15H14O6 表儿茶素 7-1 16.743 863.1828 C45H36O18 A型原花青素三聚体 7-2 16.743 863.6838 C45H36O18 A型原花青素三聚体 7-3 16.743 575.1206 C30H24O12 A型原花青素二聚体 8 17.289 577.1358 C30H26O12 B型原花青素二聚体 9 19.099 575.1197 C30H24O12 A型原花青素二聚体 10 23.343 609.1475 C27H30O16 芦丁 
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表 2 P4组分多酚组成成分分析
Table 2 The polyphenols composition analysis of P4
编号 保留时间（min） 质荷比（m/z） 分子式 化合物名称 1 16.102 575.1203 C45H36O18 原花青素A4 2-1 20.122 575.1204 C45H36O18 原花青素A2 2-2 20.122 1151.2437 C60H48O24 A型原花青素四聚体 3 23.959 575.1197 C45H36O18 A型原花青素二聚体
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