Study on Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Fish Bone Paste and Flavor Characteristics of Hydrolysates
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摘要: 以鳕鱼骨制备的超微细鱼骨泥为对象，研究鱼骨泥酶解的最佳工艺条件，以水解度为指标，在单因素的基础上，利用响应面优化酶解工艺，并根据电子鼻、电子舌、气相离子迁移色谱（GC-IMS）、游离氨基酸检测结果，分析酶解对鱼骨泥呈味特性的影响。结果表明，鱼骨泥最佳酶解工艺为：选用风味蛋白酶，酶解时间5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，在此条件下水解度可达43.8%。电子鼻分析结果显示，酶解液中芳香物质增多，烷烃、氨类等具有不良风味的化合物含量降低；电子舌分析结果显示，酶解液酸味提升，苦味减少，整体呈味特性良好、滋味丰富。鱼骨泥和酶解液中共检测出29种风味物质，其中鱼骨泥中主要挥发性风味物质是醛类和酮类，酶解液中主要呈味物质是酮类和酯类，挥发性风味物质的种类及含量差异显著。酶解增加了呈味氨基酸的含量，赋予了酶解液良好的风味。Abstract: Taking the ultra-fine fish bone paste prepared from cod bones as the object, the conditions of enzymatic hydrolysis of fish bone paste were optimized by using the single factor experiment and response surface design based on the degree of hydrolysis as an indicator. Meanwhile, the changes of flavor characteristics of fish bone paste and its hydrolysates were analyzed by employing electronic nose, electronic tongue, gas-phase ion migration chromatography(GC-IMS), and free amino acid determination. The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were obtained at hydrolysis time of 5 hours, enzyme addition of 1.0%, material-liquid ratio of 1:1 by using flavor protease, yield 43.8% of hydrolysis degree. The electronic nose analysis results showed that the aromatic substances in the hydrolysate increased, while the content of undesirable compounds such as alkanes and ammonia decreased. The results of electronic tongue analysis showed that the acidity of the hydrolysate was increased, while the bitterness was reduced, and the overall taste was good and rich. There were 29 volatile compounds of hydrolysate and fish bone paste were detected by GC-IMS. In fish bone paste, the main volatile flavor substances were aldehydes and ketones, and the main flavor substances in the hydrolysate were ketones and esters. These types and contents of volatile flavor substances were significantly different. The hydrolysate increased the content of flavored amino acids and the hydrolysate had a good flavor.
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Keywords:
- fish bone paste /
- enzymatic hydrolysis /
- flavor /
- taste compound
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我国水产加工行业每年加工量超过1000万吨，通常鱼头骨和脊骨占鱼体重的10%~15%，是仅次于鱼皮的第二大加工副产物[1]。鱼骨排具有高蛋白、低脂肪的营养特性，钙磷比接近2:1，营养价值丰富。然而，我国在水产品加工和综合利用方面比较落后，加工时产生的副产物如鱼骨排等得不到有效地利用，造成了极大的经济损失和环境压力，其开发利用已引起行业高度重视。因此，对鱼骨资源进行高值化利用具有一定的研究意义。但目前，关于鱼骨排加工利用的研究报道主要集中在即食鱼骨和鱼骨泥的制作与应用等方面[2-4]，有关鱼骨泥酶解及其呈味特性的研究仍鲜见报道。
酶解技术反应条件温和，酶解产物安全性高，在动植物蛋白资源加工利用、生物多肽制备、香气改善等方面应用广泛。鱼骨排经酶解可以释放出多肽、游离氨基酸等物质，可改善风味，提高营养价值与应用范围。ATMA等[5]利用酶解技术从鱼骨中获取生物活性多肽；TAN等[6]将鳕鱼骨高温处理后进行酶解，发现酶解液具有较好的营养价值；杨会成等[7]将金枪鱼骨酶解制备成骨胶原蛋白肽，再与柠檬酸钙进行螯合，研究发现钙肽螯合物具有增加成骨细胞分泌碱性磷酸酶的生物活性作用；毛毛等[8]利用高压脉冲电场技术与复合酶解技术对骨胶原多肽风味进行了优化研究；董烨等[9]研究了不同预处理方式对鳙鱼酶解液的氨基酸和挥发性成分的影响；这些研究为鱼骨排的高值化利用提供了一定参考。
为了提高鱼骨排的酶解效率，采用超微粉碎的预处理方式将鱼骨排制备成鱼骨泥。超微粉碎作为一种绿色高效的原料处理方法，被广泛应用于骨制品的预处理中。鱼骨在超微粉碎过程中，受到剪切和挤压力的作用，胶原蛋白三维结构遭到破坏，营养物质流出，同时增强了蛋白酶和底物的碰撞，有利于提升酶解效率，提高呈味化合物的含量，有益于整体风味的提升。
本研究以鳕鱼骨排为主要原料，采用超微粉碎法制备鱼骨泥后再进行酶解处理，对鱼骨泥酶解工艺进行了深入探究，通过单因素实验和响应面试验获得了最佳酶解条件。在此基础上，对鱼骨泥和酶解液的风味及呈味化合物进行了深度对比，剖析了酶解对鱼骨泥呈味特性的影响，为鱼骨副产物的综合利用提供的一定参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鳕鱼骨排 大连天宝绿色食品股份有限公司；木瓜蛋白酶（80万 U/g）、中性蛋白酶（20万 U/g）、风味蛋白酶（3万 U/g） 丹麦诺维信公司；NaOH滴定液 阿拉丁试剂（上海）有限公司；氯化钾、甲醛 国药集团化学试剂有限公司。
SQW-6J细胞破壁超微粉碎机 济南三清易辰超微粉碎技术有限公司；SORVALL Stratos型冷冻高速离心机 美国Thermo公司；FOSS 8400全自动定氮仪 瑞典FOSS公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立高新技术公司；PEN3便携式电子鼻 德国AIRSENSE公司；ZB-20 型斩拌机 诸城市瑞恒食品机械厂；SA402B电子舌 日本Nikon公司；avourSpec®风味分析仪 中国海能仪器股份有限公司；RRH-A250型高速万能粉碎机 上海缘沃工贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鱼骨排基本成分的测定
鱼骨中水分、灰分、蛋白质、脂肪含量分别按 GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》直接干燥法[10]、GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》高温灰化法[11]、GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法[12]、GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》索氏提取法[13]进行测定。
1.2.2 鱼骨泥制备工艺流程
鳕鱼骨排→清洗→切块（2 cm×2 cm）→漂白→清洗→粗粉碎 (斩拌机) →细粉碎 (骨泥机) →超微粉碎 (高精密湿法超微粉碎机) →离心脱水 (4000 r/min，5 min) →超微细鱼骨泥
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 蛋白酶种类的筛选
分别采用木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶对鱼骨泥进行酶解，以料液比为1:2（g/mL），加酶量1.5%，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h的条件进行酶解。酶解完成后，沸水浴灭酶10 min，在4 ℃条件下，5000 r/min离心10 min，获得上清液备用，以水解度为指标评价酶解效果。
1.2.3.2 酶解时间对水解度的影响
称取30 g鱼骨泥在酶解温度为 50 ℃，加酶量为1%，料液比为1:2（g/mL）的条件下，考察酶解时间2、3、4、5、6 h对水解度的影响。
1.2.3.3 加酶量对水解度的影响
称取30 g鱼骨泥在酶解温度为50℃，料液比为1:2（g/mL），酶解时间为5 h，考察酶添加量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%对水解度的影响。
1.2.3.4 料液比对水解度的影响
称取30 g鱼骨泥在酶解温度为50 ℃，加酶量为1%，酶解时间为5 h，考察料液比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（g/mL）对水解度的影响。
1.2.4 响应面试验
在研究酶解时间、料液比、加酶量这三个单因素实验的基础上，为进一步研究酶解效果，在50 ℃条件下利用风味蛋白酶酶解，以水解度为指标，利用Design Expert 8.0软件，采用Box-Behnken设计三因素三水平响应面试验，确定酶解鱼骨泥最佳工艺，因素水平见表1。
表 1 响应面试验设计因素与水平Table 1. Factors and levels of response surface experimental design因素 水平 −1 0 1 A酶解时间(h) 3 4 5 B加酶量(%) 0.6 0.8 1.0 C料液比(g/mL) 1:3 1:2 1:1 1.2.5 水解度的测定
采用甲醛滴定法，按照下式计算：
(1) 式中：总氮含量采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定[12]；氨基酸态氮含量采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定[14]。
1.2.6 电子鼻测定
参考GAO[15]的方法略有修改，准确称取10 g样品于50 mL烧杯内，酶解液称取15 mL，用三层保鲜膜密封，室温下静置20 min，然后依次用电子鼻对挥发性气味进行分析检测，每组样品做3个平行。电子鼻载气为干燥空气，设置测试时间为120 s，清洗时间为120 s。
1.2.7 电子舌测定
准确称取30 g样品于料理机中，按照料水比1:4（g/mL）的比例加入蒸馏水，绞碎、混匀，再以9000 r/min离心10 min，再经0.45 µm和0.22 µm滤膜抽滤至澄清；酶解液的前处理方法同样品，准确称取30 mL酶解液按照料水比1:4（g/mL）的比例混匀，离心、抽滤；分别取40 mL的上清液于电子舌专用样品杯中。按照设置的序列放置在电子舌自动进样器上进行检测，单次采样时间为120 s，1次/s。每组样品重复检测4次，运用系统自带数据库系统，选取传感器信号趋于稳定时即第120 s的响应值，对后3次采集到的数据进行味觉特征分析。
1.2.8 GC-IMS检测
称取2.0 g样品和2 mL酶解液分别置于20 mL顶空瓶中，设置孵育温度60 ℃，孵化转数500 r/min，孵育15 min，采用顶空自动进样，进样体积为500 µL，进样针温度65 ℃。色谱柱类型：MXT-5 (15 m×0.53 mm，1 µm)，柱温60 ℃，IMS温度45 ℃，分析时间30 min，载气/漂移气为N2。
1.2.9 游离氨基酸测定
称取5.0 g样品于料理机中绞碎后，以9500 r/min匀浆三次（每次10 s），加入20 mL超纯水，然后加入5%三氯乙酸20 mL，搅拌均匀。于4 ℃静置12 h，用中性定性滤纸过滤，去除悬浮物。然后加入超纯水，得到最终体积为50 mL。样品经过0.22 µm滤膜，注入自动氨基酸分析仪。
1.3 数据统计分析
每组实验重复3次取平均值，采用 SPSS 19.0 软件进行方差分析处理，以 Duncan’s 法进行检验，取95%置信度（P<0.05），结果以均值±标准差表示。利用 Origin 9.0 软件作图。GC-IMS结果通过Reporter插件直接对比样品间谱图差异（二维俯视图、三维谱图），结合Gallery Plot插件对指纹图谱对比。
2. 结果与分析
2.1 鱼骨排基本成分测定结果
鱼骨排中基本成分含量如表2所示，鱼骨中营养物质含量丰富，具有高蛋白、低脂肪的特点，适用于后续鱼骨泥酶解的研究。
表 2 鳕鱼骨排的营养组成成分表Table 2. Nutrient composition of cod bone row组成 水分 蛋白质 灰分 脂肪 含量（%) 74.20±1.06 13.33±0.55 6.83±0.06 2.24±0.21 2.2 单因素实验结果
酶解法便于控制且反应条件温和，由于蛋白酶具有专一性和选择性，可以赋予酶解液不同的风味[16-18]。以水解度为指标，研究不同蛋白酶的酶解效果。使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶对鱼骨泥进行酶解，实验结果如图1(A)所示，可以看出不同蛋白酶对鱼骨泥水解度的影响差异显著（P<0.05）。在风味蛋白酶作用下，酶解液的水解度最高，为33.83%。有研究表明，风味蛋白酶可以赋予酶解液较好的风味[19]，而且可以将肽链末端的疏水性氨基酸切除，降低苦味[20]，因此选取风味蛋白酶为水解用酶。
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图 1 不同因素对水解度的影响注：A.蛋白酶种类；B.酶解时间；C.加酶量；D.料液比；不同小写字母表示差异显著（ P <0.05）。Figure 1. Effect of different factors on the degree of hydrolysis不同酶解时间对鱼骨泥水解度的影响如图1(B)所示。由图可知，酶解4 h后，水解度增加不明显，酶解5 h时水解度达到最大值，这可能是因为随着时间的延长，反应体系中的底物基本被完全酶解，酶解过程基本结束，故选取4~6 h为最佳酶解时间段。
不同加酶量对鱼骨泥水解度的影响如图1(C)所示。由图可知，加酶量在0.2%~1.0%范围内，水解度随着酶添加量的增多呈现先上升后下降的趋势，在添加量为0.8%时水解度最大。这是由于蛋白酶添加量增多时，酶与底物的触点增多，酶解效果显著提高，但当酶添加量过多时，酶与底物作用位点被完全占据，即此时的鱼骨泥不能满足更多蛋白酶酶解所需的营养成分，因此继续增加蛋白酶含量水解度没有提升，故选取0.6%~1.0%为最佳蛋白酶添加量范围。
不同料液比对鱼骨泥水解度的影响如图1(D)所示。由图可知，水解度随料液比的增加呈下降趋势，这可能是由于料液比浓度较低时，物料粘稠，增大了酶与底物间的碰撞接触，酶解效率较高，但当料液比低于1:1 g/mL时，物料过于粘稠，影响酶解效率。当料液比浓度增大时，酶与底物不能进行有效接触，水解度下降，同时由于料液比增大，对溶液中的可溶性肽有一定的稀释作用，故水解度下降，因此最佳料液比范围选取1:1~1:3 g/mL。
2.3 响应面分析
以酶解时间（A）、加酶量（B）、料液比（C）三个因素为自变量，水解度为响应值，进行Box-Behnken试验设计，采用三因素三水平进行酶解工艺条件优化，Box-Behnken试验结果见表3。
表 3 响应面试验设计结果Table 3. Response surface test design results组别 A酶解时间 B加酶量 C料液比 水解度（%） 1 1 −1 0 28.04 2 1 0 −1 27.38 3 −1 −1 0 29.93 4 −1 0 −1 28.49 5 −1 1 0 29.94 6 0 0 0 34.84 7 0 0 0 32.16 8 0 0 0 30.38 9 0 0 0 30.83 10 −1 0 1 36.62 11 1 1 0 32.61 12 0 1 −1 27.93 13 1 0 1 40.51 14 0 −1 −1 28.15 15 0 −1 1 40.07 16 0 0 0 33.05 17 0 1 1 43.64 2.3.1 回归模型的建立及显著性、可信性分析
对实验数据进行多元回归拟合，建立水解度（R）对时间（A）、酶添加量（B）、料液比（C）多元二次回归模型：
R=3.1488+0.09A−0.093B−0.075C−0.077AB+0.195AC−0.015BC−0.35A2−0.478B2−0.298C2。方差分析结果如表4所示，回归模型P值为0.0008，达到了极显著水平，失拟项不显著，表明模型对实验拟合良好，可以用该模型来分析和预测酶解鱼骨泥的工艺结果。C、C2的影响极显著（P<0.01），A2对结果的影响显著（P<0.05），三种因素对水解度影响的顺序为：料液比>加酶量>时间。
表 4 响应面回归模型方差分析表Table 4. Variance table of response surface regression model analysis来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 371.95 9 41.33 15.57 0.0008 ** A 酶解时间 1.59 1 1.59 0.60 0.4637 B 加酶量 7.84 1 7.84 2.95 0.1293 C 料液比 298.77 1 298.77 112.54 <0.0001 ** AB 5.19 1 5.19 1.96 0.2046 AC 6.27 1 6.27 2.36 0.1683 BC 3.59 1 3.59 1.35 0.2832 A2 15.36 1 15.36 5.78 0.0471 * B2 0.19 1 0.19 0.0701 0.7979 C2 35.56 1 35.56 13.39 0.0081 ** 残差 18.58 7 2.65 失拟项 5.74 3 1.91 0.60 0.6505 不显著 绝对误差 12.84 4 3.21 总离差 390.54 16 注: **表示极显著(P<0.01) ；*表示显著(P<0.05)。 2.3.2 响应面交互作用分析
各因素间的交互作用如图2所示，由图可知，随着酶解时间的延长，水解度呈先上升后下降的趋势，随着料液比的增大，水解度呈现下降趋势。由响应曲面的陡峭程度可以看出，料液比与其它两因素间的交互较好。等高线图的形状可以反映出两因素交互作用的强弱和显著程度[21]。料液比与其余两个因素交互的曲线比较陡，说明在酶解时间不是很充分和加酶量较少时，降低料液比浓度能明显提高水解度。
2.3.3 最佳酶解条件的确定及验证实验
利用 Design-Expert统计软件求解回归方程得到，以水解度为指标，酶解鱼骨泥的最佳工艺为：时间5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，水解度可达43.92%，在上述最优条件下进行验证实验，水解度可达43.8%，接近预测值。证明通过响应面分析获得的最佳条件是有效可靠的。
2.4 酶解对鱼骨泥气味轮廓的影响
将鱼骨泥、鱼骨泥酶解液挥发性气体变化进行PCA 分析，其目的是将电子鼻输出的数据降维成两个不存在信息交叉的新指标，使得原本复杂并可能存在相互影响的数据变得简单明了，性质相似的样品在距离上接近[22-23]。根据图3(A)可以看出，PC1与PC2的贡献率分别为84.50%和8.68%，两者贡献率之和达93.18%，说明主成分包含了样品的主要气味信息。两组样品主成分没有重叠交互的部分，说明两组样品间气味具有一定差异性。主要表现在酶解后的气味向PC1正向移动，而PC1特征值占比较大，说明鱼骨泥经酶解后，气味特征越发复杂，和鱼骨泥气味差异较大。
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图 3 鱼骨泥和酶解液电子鼻响应值的PCA(A)和雷达图(B)Figure 3. PCA and radar chart of electronic nose response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates根据电子鼻雷达图可以看出鱼骨泥酶解前后的挥发性气体传感器响应值的变化。从图3(B)中可以看出R2、R5、R6、R7的响应值变化较为明显，R2对氮氧化合物灵敏、R5对芳香化合物灵敏、R6对甲烷灵敏、R7对无机硫化物灵敏。鱼腥味主要构成物质是三甲胺，其反应会生成较多的短链烷烃类化合物，酶解后烷烃类化合物含量有所降低。总体来说，酶解可以产生更多的芳香物质和含硫化合物，同时使鱼骨泥中烷烃类、氨类等具有不愉快气味化合物的含量降低，表明酶解可以改善鱼骨泥的整体风味。
2.5 酶解对鱼骨泥滋味轮廓的影响
电子舌可以有效的反映各样品间的滋味差异，图4反映出鱼骨泥、酶解鱼骨泥各滋味响应值的强度。从图中可以看出，鱼骨泥酶解前后滋味轮廓具有一定的差异性，酶解液的滋味轮廓较大。主要表现为酸味、苦味和咸味的差异，酶解后苦味响应值降低，说明酶解可以对苦味产生一定的削弱作用。酶解液的酸味响应值高于鱼骨泥，酸味可以对苦味产生一定的掩盖作用。在陶宁萍等[24]的研究中，对鱼皮进行脱苦后，酸味亦有上升趋势。咸味可以赋予水产品良好的风味，鱼骨泥经酶解后咸味具有上升趋势，这可能是因为蛋白质水解后产生了具有咸味或类似咸味作用的肽。TAMURA等[25]在酪蛋白水解物类似物合成过程中偶然发现具有咸味的肽，ALEXANDER等[26]研究发现，鱼精蛋白酶解产物经分离纯化得到的精酰胺二肽具有咸味增强作用。
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图 4 鱼骨泥和酶解液电子舌响应值的雷达图Figure 4. Radar chart of electronic tongue response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates2.6 酶解对鱼骨泥挥发性风味物质的影响
图5为不同处理方式下鱼骨泥特征风味二维和三维GC-IMS谱图，图中每个数据点代表一种挥发性化合物，数量信息用颜色表示，白色对应于相对较低浓度的挥发物，红色对应较高浓度的挥发物。在1.0~1.5 ms漂移范围内，酶解液的信号响应高于鱼骨泥，可以看出两组样品间具有一定的差异。
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图 5 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液的 GC-IMS 三维(A)、二维(B)谱图注：a：鱼骨泥；b：鱼骨泥酶解液。Figure 5. GC-IMS 3D (A) and 2D (B) spectra of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates为更加直观的对比两组样品挥发性风味物质的差异，将二维图谱中所有的待分析峰整合成指纹图谱，如图6 所示，图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，图中每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，两组样品间的挥发性风物物质在种类和含量上的差异均十分显著（表5）。A区域是鱼骨泥中主要呈味物质，表现为癸醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、辛醛、苯甲醛、庚醛、E-2-己烯醛、己醛、E-2-戊烯醛、戊醛、2-壬酮、2-戊酮、2-乙基己醇、二甲基硫醚等物质的含量较高；B区域是酶解液中主要呈味物质，表现为2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、壬醛、E-2-辛烯醛、3-辛酮、2-庚酮、环己酮、异己醇、2-丙醇、3-甲基丁酸乙酯、丁酸戊酯等物质的含量较高。
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图 6 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液的挥发性物质成分差异化谱图注：GN：鱼骨泥；MJ：鱼骨泥酶解液；区域A：鱼骨泥主要呈味物质；区域B：酶解液主要呈味物质。Figure 6. Differential spectrum of volatile components in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates醛类化合物是酶解液和鱼骨泥中主要的挥发性风味物质之一，醛类物质的阈值较低，对气味形成的贡献较大[27]，含有6~9个碳原子的醛、烯醛类物质一般具有清香、果香和脂香味。鱼骨泥中的主要呈味物质是醛类化合物，如庚醛、辛醛具有青草味、鱼腥味和令人不愉快的气味[28]，苯甲醛有杏仁的味道，可能与氨基酸的降解有关[29]，（E,Z）-2,6-壬二烯醛是鱼腥味的特征化合物。酶解液中壬醛含量较高，具有强烈的油脂气味和甜橙气息。醛类物质是水产品主要的风味物质，经过酶解作用，可以减少鱼骨泥中的不良风味。
酮类和醇类物质主要来源于脂肪氧化，部分还可与美拉德反应和硫胺素降解的化学物质反应，对香气形成具有较大贡献[30]。酮类化合物是酶解液中主要呈味物质，其阈值一般高于醛类。鱼骨泥中酮类物质主要有2-壬酮、2-戊酮、甲基庚烯酮等，具有柠檬草香味和柑橘样气息。酶解产生了一些新的酮类物质，如3-辛酮、2-庚酮、二氢香芹酮等，具有水果和药草等香气。醇类阈值较高，对气味影响较小[31]，检测出的种类也相对较少，醇类物质一般具有令人愉悦的气味，2-乙基己醇有甜味和淡淡的花香。不饱和醇类的临界值较饱和醇低，因此对于气味形成贡献较大，1-辛烯-3-醇具有蘑菇和泥土味等香气。醇类物质具有良好的风味，能够掩盖不良气味，因此可以掩盖一定的腥味。
表 5 鱼骨泥和酶解液挥发性化合物的定性分析Table 5. Qualitative analysis of volatile compounds in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
编号化合物
名称分子式 CAS号 保留
指数保留
时间(s)迁移
时间(ms)气味 1 癸醛 C10H20O 112-31-2 737.75 1.54 1272.6 香气青辛微甜 2 反-2-,顺-6-壬二烯醛 C9H14O 557-48-2 602.29 1.37 1178.4 具有强烈的紫罗兰和黄瓜似香气 3 壬醛 C9H18O 124-19-6 507.76 1.48 1112.7 具有强烈的油脂气味和甜橙气息 4 2-壬酮 C9H18O 821-55-6 483.40 1.41 1095.8 呈水果、花、油脂和药草似香气 5 2-乙基-3,5-二甲基吡嗪 C8H12N2 55031-15-7 448.91 1.23 1071.8 吡啶类香料 6 2-乙基己醇 C8H18O 104-76-7 394.29 1.42 1033.8 有甜味和淡淡的花香 7 3-辛酮 C8H16O 106-68-3 339.07 1.31 994.6 8 甲基庚烯酮 C8H14O 110-93-0 339.81 1.18 995.5 该品具有水果香气和新鲜清香香气 9 苯甲醛-D{1} C7H5DO 3592-47-0 312.56 1.47 962.6 10 2-庚酮 C7H14O 110-43-0 256.18 1.26 894.6 具有香味 11 4-甲基-1-戊醇 C6H14O 626-89-1 221.40 1.32 826.9 12 D-甘露糖 C6H12O6 3458-28-4 203.89 1.56 791.9 味甜，略带苦的后味 13 1-戊醇 C5H12O 71-41-0 190.31 1.25 758.9 略有气味 14 2-戊酮 C5H10O 107-87-9 160.36 1.36 675.6 具酒和丙酮气味 15 丁醛 C4H8O 123-72-8 135.40 1.29 565.1 有窒息性醛味 16 丙醛 C3H6O 123-38-6 122.00 1.05 505.8 有窒息性刺激气味 17 异丙醇 C3H8O 67-63-0 127.41 1.22 529.7 有似乙醇的气味 18 乙醇 C2H6O 64-17-5 104.95 1.04 430.3 有酒的气味和刺激性辛辣味 19 二甲基硫 C2H6S 75-18-3 107.79 0.98 442.8 有难闻的气味 20 丁酸戊酯 C9H18O2 540-18-1 437.59 1.41 1063.9 呈强烈穿透性臭昧，有甜味 21 水芹烯 C10H16 99-83-2 353.84 1.23 1005.7 具有黑胡椒和蔼荷似香气 22 二氢香芹酮 C10H16O 5524-05-0 259.46 1.46 898.6 浓而强烈的药草样气味，留兰香样的风味 23 丙酮 C3H6O 67-64-1 112.69 1.12 464.5 24 2-丁酮 C4H8O 78-93-3 131.67 1.25 548.6 25 正己醇 C6H14O 111-27-3 245.51 1.32 874.9 有淡青的嫩枝叶气息，微带酒香、果香和脂肪气息 26 糠醛 C5H4O2 35796 222.74 1.08 829.5 有类似苯甲醛的特殊气味 27 1-辛烯-3-醇 C8H16O 3391-86-4 331.71 1.16 985.7 有蘑菇和泥土味等香气 28 反-2-辛烯醛 C8H14O 2548-87-0 427.24 1.33 1056.7 肥腻香气 29 异戊酸乙酯 C7H14O2 108-64-5 237.88 1.26 859.7 有类似苹果、香蕉的香气和酸甜气味 2.7 酶解对鱼骨泥呈味化合物的影响
游离氨基酸具有甜味、苦味和鲜味等呈味特性，对食品风味的形成具有重要贡献[32-34]。根据表6可知，两组样品中共检测出15种游离氨基酸，其中必需氨基酸7种，半必需氨基酸2种，非必需氨基酸6种，酶解后必需氨基酸占比达58.73%，较鱼骨泥中占比高33.53%。鱼骨泥中游离氨基酸总量为18.72 mg/100 g，酶解液中含量为1095.11 mg/100 mL，酶解后游离氨基酸的含量显著高于鱼骨泥，说明酶解液的水解程度较高。
表 6 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液游离氨基酸的含量Table 6. Free amino acid content of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates分类 名称 鱼骨泥 鱼骨泥酶解液 含量(mg/100 g) 占比(%) 含量(mg/100 mL) 占比(%) 必需氨基酸 蛋氨酸 0.01 0.04 1.71 0.16 苯丙氨酸 0.85 4.52 113 10.32 赖氨酸 1.36 7.27 107.00 9.77 亮氨酸 0.45 2.40 187.00 17.08 苏氨酸 1.30 6.95 99.90 9.12 缬氨酸 0.38 2.04 74.10 6.77 异亮氨酸 0.37 1.98 60.50 5.52 半必需氨基酸 组氨酸 0.00 0.00 24.20 2.21 精氨酸 3.10 16.56 115.00 10.50 非必需氨基酸 丙氨酸 2.05 10.95 62.20 5.68 甘氨酸 2.31 12.34 33.60 3.07 谷氨酸 2.05 10.95 27.40 2.50 酪氨酸 1.47 7.85 120.00 10.96 丝氨酸 2.02 10.79 56.20 5.13 天冬氨酸 1.00 5.34 13.30 1.21 总量 18.72 100.00 1095.11 100.00 必需氨基酸总量∑EAA 4.72 25.20 643.21 58.73 非必需氨基酸总量∑NEAA 10.90 58.24 312.70 28.55 半必需氨基酸总量∑HEAA 3.10 16.56 139.20 12.71 蛋氨酸、组氨酸是苦味氨基酸[35]，蛋氨酸的含量远低于阈值30 mg/100 mL，有研究表明当苦味氨基酸含量低于阈值时，对总体滋味有利[36]，组氨酸仅在酶解液中检出，其呈味阈值为20 mg/100 mL，酶解液中含量为24.20 mg/100 mL，是酶解液中苦味的主要贡献氨基酸。天冬氨酸、谷氨酸具有鲜甜味[37]，其阈值分别为100 和30 mg/100 mL，酶解液中谷氨酸含量为27.4 mg/100 mL，对于鲜味的贡献高于天冬氨酸。甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸具有甜味，能够赋予食品总体较好的风味[38]，这些具有良好风味的氨基酸在酶解后含量均提升数倍，说明酶解液的风味更佳。陈怡颖等[39]分别研究了鸡肉酶解液和鸡肉中风味成分，分析结果发现鸡肉酶解液中风味成分更丰富，风味更佳。
3. 结论
本研究通过单因素和响应面试验优化了鱼骨泥酶解工艺，得到最佳工艺条件为：采用风味蛋白酶，酶解时间5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，在此条件下水解度可达43.8%。酶解前后的鱼骨泥气味和滋味特征有明显差异。酶解降低了鱼骨泥的苦味和腥味，改变了挥发性风味物质的组成。鱼骨泥中主要呈味物质是醛酮类化合物，酶解液中主要呈味物质为酮类、酯类化合物；酶解液中游离氨基酸的含量显著高于鱼骨泥中，赋予了酶解液整体较好的滋味。
本研究建立了鱼骨泥的酶解工艺，为鱼骨副产物的深加工提供了一定思路。后续研究可以根据分子量分布对酶解液中的肽段进行分离纯化，深入探究酶解液中呈味物质组成及呈味机制。亦可将鱼骨酶解液应用到调味料的研制中，赋予食品水产品特有的风味。
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图 1 不同因素对水解度的影响
注：A.蛋白酶种类；B.酶解时间；C.加酶量；D.料液比；不同小写字母表示差异显著（ P <0.05）。
Figure 1. Effect of different factors on the degree of hydrolysis
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图 3 鱼骨泥和酶解液电子鼻响应值的PCA(A)和雷达图(B)
Figure 3. PCA and radar chart of electronic nose response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
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图 4 鱼骨泥和酶解液电子舌响应值的雷达图
Figure 4. Radar chart of electronic tongue response value of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
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图 5 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液的 GC-IMS 三维(A)、二维(B)谱图
注：a：鱼骨泥；b：鱼骨泥酶解液。
Figure 5. GC-IMS 3D (A) and 2D (B) spectra of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
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图 6 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液的挥发性物质成分差异化谱图
注：GN：鱼骨泥；MJ：鱼骨泥酶解液；区域A：鱼骨泥主要呈味物质；区域B：酶解液主要呈味物质。
Figure 6. Differential spectrum of volatile components in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
表 1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experimental design
因素 水平 −1 0 1 A酶解时间(h) 3 4 5 B加酶量(%) 0.6 0.8 1.0 C料液比(g/mL) 1:3 1:2 1:1 
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表 2 鳕鱼骨排的营养组成成分表
Table 2 Nutrient composition of cod bone row
组成 水分 蛋白质 灰分 脂肪 含量（%) 74.20±1.06 13.33±0.55 6.83±0.06 2.24±0.21
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表 3 响应面试验设计结果
Table 3 Response surface test design results
组别 A酶解时间 B加酶量 C料液比 水解度（%） 1 1 −1 0 28.04 2 1 0 −1 27.38 3 −1 −1 0 29.93 4 −1 0 −1 28.49 5 −1 1 0 29.94 6 0 0 0 34.84 7 0 0 0 32.16 8 0 0 0 30.38 9 0 0 0 30.83 10 −1 0 1 36.62 11 1 1 0 32.61 12 0 1 −1 27.93 13 1 0 1 40.51 14 0 −1 −1 28.15 15 0 −1 1 40.07 16 0 0 0 33.05 17 0 1 1 43.64
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表 4 响应面回归模型方差分析表
Table 4 Variance table of response surface regression model analysis
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 371.95 9 41.33 15.57 0.0008 ** A 酶解时间 1.59 1 1.59 0.60 0.4637 B 加酶量 7.84 1 7.84 2.95 0.1293 C 料液比 298.77 1 298.77 112.54 <0.0001 ** AB 5.19 1 5.19 1.96 0.2046 AC 6.27 1 6.27 2.36 0.1683 BC 3.59 1 3.59 1.35 0.2832 A2 15.36 1 15.36 5.78 0.0471 * B2 0.19 1 0.19 0.0701 0.7979 C2 35.56 1 35.56 13.39 0.0081 ** 残差 18.58 7 2.65 失拟项 5.74 3 1.91 0.60 0.6505 不显著 绝对误差 12.84 4 3.21 总离差 390.54 16 注: **表示极显著(P<0.01) ；*表示显著(P<0.05)。
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表 5 鱼骨泥和酶解液挥发性化合物的定性分析
Table 5 Qualitative analysis of volatile compounds in fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
编号化合物
名称分子式 CAS号 保留
指数保留
时间(s)迁移
时间(ms)气味 1 癸醛 C10H20O 112-31-2 737.75 1.54 1272.6 香气青辛微甜 2 反-2-,顺-6-壬二烯醛 C9H14O 557-48-2 602.29 1.37 1178.4 具有强烈的紫罗兰和黄瓜似香气 3 壬醛 C9H18O 124-19-6 507.76 1.48 1112.7 具有强烈的油脂气味和甜橙气息 4 2-壬酮 C9H18O 821-55-6 483.40 1.41 1095.8 呈水果、花、油脂和药草似香气 5 2-乙基-3,5-二甲基吡嗪 C8H12N2 55031-15-7 448.91 1.23 1071.8 吡啶类香料 6 2-乙基己醇 C8H18O 104-76-7 394.29 1.42 1033.8 有甜味和淡淡的花香 7 3-辛酮 C8H16O 106-68-3 339.07 1.31 994.6 8 甲基庚烯酮 C8H14O 110-93-0 339.81 1.18 995.5 该品具有水果香气和新鲜清香香气 9 苯甲醛-D{1} C7H5DO 3592-47-0 312.56 1.47 962.6 10 2-庚酮 C7H14O 110-43-0 256.18 1.26 894.6 具有香味 11 4-甲基-1-戊醇 C6H14O 626-89-1 221.40 1.32 826.9 12 D-甘露糖 C6H12O6 3458-28-4 203.89 1.56 791.9 味甜，略带苦的后味 13 1-戊醇 C5H12O 71-41-0 190.31 1.25 758.9 略有气味 14 2-戊酮 C5H10O 107-87-9 160.36 1.36 675.6 具酒和丙酮气味 15 丁醛 C4H8O 123-72-8 135.40 1.29 565.1 有窒息性醛味 16 丙醛 C3H6O 123-38-6 122.00 1.05 505.8 有窒息性刺激气味 17 异丙醇 C3H8O 67-63-0 127.41 1.22 529.7 有似乙醇的气味 18 乙醇 C2H6O 64-17-5 104.95 1.04 430.3 有酒的气味和刺激性辛辣味 19 二甲基硫 C2H6S 75-18-3 107.79 0.98 442.8 有难闻的气味 20 丁酸戊酯 C9H18O2 540-18-1 437.59 1.41 1063.9 呈强烈穿透性臭昧，有甜味 21 水芹烯 C10H16 99-83-2 353.84 1.23 1005.7 具有黑胡椒和蔼荷似香气 22 二氢香芹酮 C10H16O 5524-05-0 259.46 1.46 898.6 浓而强烈的药草样气味，留兰香样的风味 23 丙酮 C3H6O 67-64-1 112.69 1.12 464.5 24 2-丁酮 C4H8O 78-93-3 131.67 1.25 548.6 25 正己醇 C6H14O 111-27-3 245.51 1.32 874.9 有淡青的嫩枝叶气息，微带酒香、果香和脂肪气息 26 糠醛 C5H4O2 35796 222.74 1.08 829.5 有类似苯甲醛的特殊气味 27 1-辛烯-3-醇 C8H16O 3391-86-4 331.71 1.16 985.7 有蘑菇和泥土味等香气 28 反-2-辛烯醛 C8H14O 2548-87-0 427.24 1.33 1056.7 肥腻香气 29 异戊酸乙酯 C7H14O2 108-64-5 237.88 1.26 859.7 有类似苹果、香蕉的香气和酸甜气味
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表 6 鱼骨泥和鱼骨泥酶解液游离氨基酸的含量
Table 6 Free amino acid content of fish bone paste and its enzymatic hydrolysates
分类 名称 鱼骨泥 鱼骨泥酶解液 含量(mg/100 g) 占比(%) 含量(mg/100 mL) 占比(%) 必需氨基酸 蛋氨酸 0.01 0.04 1.71 0.16 苯丙氨酸 0.85 4.52 113 10.32 赖氨酸 1.36 7.27 107.00 9.77 亮氨酸 0.45 2.40 187.00 17.08 苏氨酸 1.30 6.95 99.90 9.12 缬氨酸 0.38 2.04 74.10 6.77 异亮氨酸 0.37 1.98 60.50 5.52 半必需氨基酸 组氨酸 0.00 0.00 24.20 2.21 精氨酸 3.10 16.56 115.00 10.50 非必需氨基酸 丙氨酸 2.05 10.95 62.20 5.68 甘氨酸 2.31 12.34 33.60 3.07 谷氨酸 2.05 10.95 27.40 2.50 酪氨酸 1.47 7.85 120.00 10.96 丝氨酸 2.02 10.79 56.20 5.13 天冬氨酸 1.00 5.34 13.30 1.21 总量 18.72 100.00 1095.11 100.00 必需氨基酸总量∑EAA 4.72 25.20 643.21 58.73 非必需氨基酸总量∑NEAA 10.90 58.24 312.70 28.55 半必需氨基酸总量∑HEAA 3.10 16.56 139.20 12.71
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