Simultaneous Determination of Five Cannabinoids in Dark Chocolate with High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
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摘要: 基于巧克力和大麻酚类物质的物理化学性质，本文通过对前处理方法和检测方法的优化，建立了一种巧克力中五种大麻酚的高效液相色谱-串联质谱检测方法。并通过精密度、重复性以及加标回收等实验对方法的有效性进行了验证。结果表明，五种大麻酚在0.05~5.0 μg/mL浓度范围内有良好的线性关系，线性相关系数R2≥0.997，定量限（LOQ，S/N=10）为0.15 mg/kg；日内和日间精密度的相对标准偏差RSDs值<5%，说明该方法具有良好的精密度和稳定性；在三个加标水平（1.25、2.50、5.00 mg/kg）下的回收率为91.8%~109.0%，RSDs<5%，说明该方法具有较高的准确性。本方法具有简单、快速、准确等优点，可以为建立巧克力中大麻酚类物质的检测方法标准奠定实验基础，同时为加强国际大麻酚添加食品进出口监管提供技术储备。
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关键词:
- 巧克力 /
- 大麻二酚 /
- Δ9-四氢大麻酚 /
- 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)
Abstract: Based on the physicochemical properties of chocolate and cannabinoids, a method for the determination of five cannabinoids in dark chocolate by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed by optimizing the pretreatment and detection methods. The validity of the method was verified by precision, repeatability and recovery experiments. Results showed that the linear range of five cannabinoids was 0.05~5.0 μg/mL with the linear correlation coefficient R2≥0.997, the limit of quantitation (LOQ, S/N=10) was 0.15 mg/kg. The RSDs of intraday precision and interday precision were below 5%, which indicated that the method had good precision and stability. The recoveries at three levels (1.25, 2.50, 5.00 mg/kg) were from 91.8% to 109.0%, with RSDs<5%, indicating that the method had high accuracy. The established method is simple, rapid and accurate, and it can lay an experimental foundation for the establishment of the standard method for the determination of cannabinoids in chocolate, and provide technical reserves for strengthening the international supervision of import and export of cannabinoids added food. -
随着大麻的使用在许多国家已经合法化[1-2]，许多大麻食品应运而生。根据美国一项针对可食用大麻产品标签使用情况的调查显示[3]，常见的食用大麻产品主要包括烘培食品、饮料、糖果及巧克力等[4]。而随着我国进出口贸易的逐年增加，一些掺杂了大麻的巧克力也进入国内，这类食品容易危害未成年人健康，所以我国也加大了此类食品的监管，海关也在着手开展相关食品品类中大麻酚类物质的检测方法规范起草工作。
文献资料显示[5-6]，大麻酚类物质结构相似，如表1所示。这些分子构型差异较小，如大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）与四氢大麻酚（THC）互为同分异构体，大麻酚类物质之间具有紧密的关联性，并且在一定条件下还可以相互转化，如四氢大麻酚酸（THCA）在一定条件下可以转化为THC和CBN[7]，这也导致此类物质在分离检测时较为困难。
表 1 常见大麻酚类物质基本信息Table 1. Essential information of common cannabinoids中文名 常见名 缩写 CAS 分子构型 大麻二酚 Cannabidiol CBD 13956-29-1 
大麻二酚酸 Cannabidiolic acid CBDA 1244-58-2 
次大麻二酚 Cannabidivarin CBDV 24274-48-4 
大麻酚 Cannabinol CBN 521-35-7 
Δ9-四氢大麻酚 Δ9-Tetrahydro-cannabinol THC 1972-08-3 
四氢大麻酚酸 Tetrahydro-cannabinolic
acidTHCA 23978-85-0 
文献报道[8]，目前检测大麻酚类物质的方法主要包括气相色谱法[9]（GC）、气相色谱-质谱联用法[10-12]（GC-MS）、高效液相色谱法[13-16]（HPLC）、液相色谱-串联质谱法[17-20]（HPLC-MS）等。在这些检测方法中，气相色谱法及气相色谱-质谱联用法主要针对易挥发类物质的检测；高效液相色谱法具有较好的普适性，但检测物质的灵敏度较低；高效液相色谱-串联质谱法则具有较高的选择性、灵敏度及准确度，更适用于基质中痕量的大麻酚类物质的检测及定量分析。
目前国内大麻酚类物质的检测方法标准主要有公安行业标准[21]及司法鉴定规范[22]，这些标准主要针对THC、CBD、CBN三种物质，样品基质为人体的毛发[23]、血液[24]、尿液[25]，大麻植株[26]，火麻油[27-28]，化妆品[29]以及药品[30]等基质中大麻酚类物质的检测方法研究也较多，但是涉及巧克力基质的方法较少。目前，美国分析化学协会（AOAC）在征集巧克力中大麻酚类物质的检测方法[31]，该方法要求目标检测物必须包含THC、CBD、CBN、THCA、大麻二酚酸（CBDA）这五种物质，说明巧克力中此五种大麻酚的同时检测是非常有必要的。
结合我国国情，为了满足进出口检验的需要，建立一种兼顾普适性、分辨率、准确度的巧克力样品中五种大麻酚类物质的分析方法是非常有必要的。本文通过优化前处理条件和色谱、质谱条件，基于高效液相色谱-串联质谱法，建立一种同时检测黑巧克力中五种大麻酚类物质的分析方法，并通过方法学验证，实现检测方法的标准化，为相关产品的安全监管奠定技术基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
CBDA、CBD、CBN、THC、THCA标准溶液1000 μg/mL 美国Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色谱纯，德国Merck公司；甲酸 色谱级，国药集团化学试剂有限公司；黑巧克力 北京物美超市。
ACCELA高效液相色谱仪、TSQQuantum Access MAX三重四极杆质谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm） 安捷伦科技有限公司；Supersil-ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B 色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm） 大连依利特分析仪器有限公司；Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Hplcone-3C18色谱柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm） 苏州麦克旺志生物技术有限公司；VM200型涡旋振荡器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII离心机 日立公司；JA5003B电子天平（精确至0.01 g） 上海越平科学仪器制造有限公司；电子恒温不锈钢水浴锅 上海虞龙仪器设备有限公司；ELGA纯水仪 威立雅水处理技术（上海）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
将黑巧克力放置在冰箱−18 ℃保存24 h，取黑巧克力200 g，用小刀将其刮成巧克力屑，放入冰箱−18 ℃保存。据文献报道[27-28]，采用甲醇经过简单的超声提取就能够实现大麻酚类物质的提取实验，因此本实验采用如下步骤进行巧克力样品的前处理实验。
准确称取黑巧克力屑0.5 g于10 mL的离心管内，盖好离心管盖，在恒温水浴锅45 ℃下加热5 min，使巧克力融化，然后加入2.5 mL的甲醇，涡旋震荡2 min，再用离心机在1000 r/min的转速下离心5 min，最后过0.22 μm的滤膜，上机。
1.2.2 检测条件
三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描模式（ESI+）和负离子扫描模式（ESI-），雾化气为液氮；扫描方式为多反应监测（MRM）；毛细管温度为350 ℃；雾化气温度为300 ℃；鞘气压力为35 Arb；辅助气压力为5 Arb；离子喷雾电压为3500 V；CID压力为1.5 Torr。
高效液相色谱仪，色谱柱：Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；柱温：30 ℃；流动相A：0.1%甲酸水（V/V）溶液，流动相B：乙腈；进样量：5 μL；流速：1800 μL/min；梯度洗脱程序：0~15 min，70%~95%B；15~15.1 min，95%~70%B；15.1~18 min，70%~70%B。
1.3 方法优化及验证
1.3.1 方法优化
实验分别对质谱部分和液相部分的实验条件进行了优化，质谱部分主要采用蠕动泵直接进样，对各个待测物的子母离子对及其碰撞能等参数分别进行优化，得出最佳的质谱条件；液相部分分别采用不同厂家的色谱柱以及不同洗脱程序进行实验优化，得出最佳的液相条件；实验还采用甲醇、乙腈等不同的提取溶剂对巧克力样品前处理等过程进行了优化。
1.3.2 线性范围、检出限及定量限
混和标准储备液：分别准确吸取1 mL的CBDA（1000 μg/mL）、CBD（1000 μg/mL）、CBN（1000 μg/mL）、THC（1000 μg/mL）、THCA（1000 μg/mL）标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成100 μg/mL的五种大麻酚混和标准储备液，−18 ℃冰箱冷藏保存，有效期为3个月。
标准工作溶液：准确吸取0.1 mL的100 μg/mL的混合标准储备液，用甲醇稀释到1 mL，得到10 μg/mL的标准中间液，分别取适量的标准中间液稀释得到0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 μg/mL的标准工作液，现配现用。
在优化的实验条件下，对7个不同浓度点的标准工作液进行液相色谱-质谱分析，以五种化合物的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制五种大麻酚的标准曲线，然后得出五种大麻酚的线性范围及线性回归方程。将添加有大麻酚标准溶液的巧克力样品按照方法前处理进行提取实验，并进行液相色谱-质谱测定，以目标组分最低水平的3倍平均信噪比为检出限（LOD），10倍平均信噪比为定量限（LOQ），计算得本方法的LOD和LOQ。
1.3.3 精密度和稳定性实验
实验对方法的日内和日间精密度进行了检测。在相同仪器条件下，实验分别以添加标准溶液的巧克力为样品，按照实验过程进行前处理实验，并进行液相色谱-串联质谱定量分析，计算样品中五种大麻酚的含量，同时计算其相对标准偏差。日内精密度：即在每d的8、10、12、14、16、18时分别对样品进行测定，计算其相对标准偏差，记为日内精密度；日间精密度：连续3 d对巧克力样品在每d的10时进行测定，并计算其相对标准偏差，记为日间精密度。最终，以日内和日间精密度对方法的精密度和稳定性进行评价。
1.3.4 方法的准确性
为验证方法的准确性，实验根据计算得到方法的定量限0.15 mg/kg以及标曲的浓度点，实验采用6个平行样品，分别取定量限的8.3、16.7和33.3倍对巧克力样品进行加标回收实验，其对应的三个加标水平即为1.25、2.50、5.00 mg/kg，且对应标曲中间的三个浓度点0.25、0.50、1.00 μg/mL，然后计算三个加标水平下的回收率及其相对标准偏差，确定该方法的准确性。
1.4 数据处理
实验采用Excel数据处理软件和Origin数据作图软件分别对实验数据进行分析和处理。实验中三个加标水平的回收率实验采用6个平行样平行测定6次，采用Excel计算平均值及其相对标准偏差，得到回收率实验结果。日内精密度采用6个平行样平行测定6次，采用Excel计算日内精密度；日间精密度连续3 d采用6个平行样平行测定6次，采用Excel计算3 d的日间精密度。色谱图均由Origin作图软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 质谱条件优化
调整仪器状态，实验采用蠕动泵直接进样的方式进行优化，配制浓度为1 μg/mL的五种大麻酚的单标溶液，经蠕动泵注入质谱仪中，分别在正离子扫描模式和负离子扫描模式下对目标物进行全扫，选择响应强度高的离子扫描模式，再进行二级质谱扫描，取目标物的三对或多对离子对，通过系统自动优化得到目标物的碰撞能和套管透镜电压，优化之后五种大麻酚的质谱参数见表2。
表 2 五种大麻酚的质谱条件优化结果Table 2. MRM parameters and MS condition for five cannabinoids序号 物质名称 离子扫描模式 离子对（m/z） 碰撞能（eV） 套管透镜电压（V） 1. CBDA − 357.0>136.0 35 78 357.0>179.0 33 357.0>191.1 33 357.0>245.0* 32 2. CBD + 315.0>123.0 32 70 315.0>193.0* 32 315.0>195.1 31 3. CBN + 311.2>123.0 31 82 311.2>223.1* 33 311.2>293.2 32 4. THC + 315.0>123.0 32 70 315.0>193.0* 32 315.0>195.1 32 5. THCA − 357.0>136.0 35 78 357.0>179.0 33 357.0>191.1 33 357.0>245.0* 32 注：*为定量离子对。 2.2 液相色谱条件优化
2.2.1 色谱柱优化
实验在相同的流动相及洗脱梯度下，采用五种色谱柱Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil-ODS2 色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D.，5.0 μm）、Supersil ODS-B色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）、Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm I.D., 5.0 μm）和Hplcone-3C18色谱柱（4.6 mm×150 mm I.D., 2.0 μm），分别对相同浓度的五种大麻酚混合标准溶液进行分离分析，其HPLC-MS/MS的总离子色谱图（Total ion chromatogram，TIC）对比见图1。
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图 1 五种不同色谱柱对五种大麻酚分离TIC谱图的对比注：（a）Zorbax SB-C18色谱柱;（b）Supersil ODS2 色谱柱;（c）Supersil ODS-B 色谱柱;（d）Cosmosil 5C18-MS-II 色谱柱;（e）Hplcone-3C18色谱柱。Figure 1. The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids by five kinds of reversed-phase C18 columns从图1可以看出，五种色谱柱均能完成五种大麻酚的分离，且工作站给出五种物质峰的分离度结果均大于1。其中Zorbax SB-C18对五种大麻酚的分离效果较好，能够达到完全分离的状态，目标物响应强度值较高，峰型也较好，五种大麻酚能够在12 min内全部流出；采用Supersil ODS2色谱柱，五种大麻酚能够达到完全分离的状态，目标物响应强度值最高，峰型也较好，但五种大麻酚完全流出时间长达17 min；采用Supersil ODS-B色谱柱，五种大麻酚能够达到完全分离的状态，五种大麻酚的响应强度值较高，但THCA峰峰型较差，出现拖尾情况，五种大麻酚完全流出时间也较长，达到16 min；采用Cosmosil 5C18-MS-II色谱柱，五种大麻酚能够达到完全分离的状态，但CBDA和CBD的响应强度值差别较大且保留时间比较接近，峰型较好，五种大麻酚完全流出时间为14 min；采用Hplcone-3C18色谱柱，五种大麻酚能够达到完全分离的状态，目标物响应强度值较高，峰型较好，但五种大麻酚完全流出时间较长，为17 min。
通过对比五种色谱柱下五种大麻酚的响应强度、保留时间及色谱峰峰型发现，安捷伦Zorbax SB-C18色谱柱对五种大麻酚分离的响应强度值较高，峰型较好，且保留时间最短，对五种大麻酚的分离效果最佳，因此最终选择Zorbax SB-C18进行后续的实验研究及方法验证。
2.2.2 洗脱模式优化
实验分别采用梯度洗脱程序和等度洗脱程序分别对五种大麻酚进行了实验条件优化，两种洗脱模式下的TIC对比见图2。通过对比发现，两种洗脱模式下五种大麻酚均能分离开，梯度洗脱模式下，五种大麻酚的峰宽较窄且较尖锐，峰型较好；等度洗脱模式下CBN、THC、THCA的峰宽较宽，且响应强度较低，保留时间较长。因此，最终选择梯度洗脱模式进行后续的实验研究及方法验证。
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图 2 不同洗脱程序下五种大麻酚分离的TIC对比图注：（a）梯度分离；（b）等度分离。Figure 2. The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids based on different separations2.3 样品前处理优化
实验采用不同的提取溶剂甲醇和乙腈，以5.00 mg/kg的添加水平进行加标实验，以五种大麻酚的回收率结果为指标，考察了不同提取溶剂对巧克力样品中五种大麻酚的提取效率并对其进行了优化，结果见表3。由表中的数据可得，当分别采用甲醇和乙腈作为提取溶剂时，五种大麻酚的加标回收率都在90.6%~96.3%范围内，均能满足实验要求，同时考虑到实验的经济成本，甲醇成本较低，且两种溶剂对巧克力中五种大麻酚均具有较好的提取效果，因此实验最终选择甲醇作为五种大麻酚的提取溶剂。同时，考察了提取溶剂的最佳使用体积，向每份巧克力样品中添加250 µL的10 µg/mL标准溶液，分别采用2.5 mL和5.0 mL的甲醇进行提取实验，对两种情况下五种大麻酚的回收率结果进行对比，发现五种大麻酚的回收率结果均较好且相当，都在89%~101.8%范围内，说明两种情况下均能够将巧克力样品中的五种大麻酚提取完全，考虑实验的试剂成本问题，最终选择2.5 mL甲醇作为提取溶剂。
表 3 不同溶剂对五种大麻酚提取效率的影响Table 3. Effects of different solvents on the extraction efficiency of five cannabinoids物质名称 甲醇 乙腈 回收率（%） RSD（%） 回收率（%） RSD（%） CBDA 93.6 1.87 91.4 5.35 CBD 93.4 2.27 92.8 2.71 CBN 90.6 3.25 93.8 0.99 THC 91.1 1.18 92.8 0.27 THCA 95.8 4.01 96.3 3.64 2.4 方法验证
2.4.1 标准曲线的线性范围、检出限和定量限
根据五种大麻酚7个浓度点对应的浓度及其响应值，分别绘制五种大麻酚的标准曲线，结果表明在0.05~5.00 µg/mL的浓度范围内，五种大麻酚的响应强度值与浓度有很好的线性关系，且五种大麻酚的线性相关系数R2≥0.997。将添加有大麻酚标准品的巧克力样品提取溶液逐步稀释，进行液相色谱-串联质谱分析，计算其峰高与基线噪音高之比，当S/N=3（S为对照品峰高，N为基线噪音高）时的对照品浓度即为方法的检出限（LOD），得到CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的检出限为0.01 µg/mL，即0.05 mg/kg；当S/N=10时的浓度为方法的定量限（LOQ），得到CBDA、CBD、CBN、THC、THCA的定量限为0.15 mg/kg，结果见表4。本文对比了其他文献方法的定量数据[13-14]，本文方法具有更低的定量限，比文献方法要低1~2个数量级，更适用于微量添加大麻酚的巧克力等食品的检测。
表 4 五种大麻酚的标准曲线线性范围、检出限及定量限Table 4. Linear range, LOD and LOQ of five cannabinoids物质名称 线性方程 线性范围（µg/mL） 相关系数（R2） LOD
（mg/kg）LOQ
（mg/kg）CBDA Y=487433+5430930X 0.05~5.0 0.9971 0.05 0.15 CBD Y=129709+2415660X 0.05~5.0 0.9988 0.05 0.15 CBN Y=122591+16333830X 0.05~5.0 0.9980 0.05 0.15 THC Y=181715+2818150X 0.05~5.0 0.9983 0.05 0.15 THCA Y=244586+4044510X 0.05~5.0 0.9973 0.05 0.15 2.4.2 精密度和稳定性
本文对方法的重现性和精密度进行了验证，其日内和日间的精密度结果见表5。根据表5数据可得，五种大麻酚在日内测定6次的相对标准偏差值RSDs范围为2.0%~4.3%，日间连续3 d测定6次的相对标准偏差RSDs范围为2.5%~4.7%，日内精密度和日间精密度二者的RSDs值均<5%，说明该方法具有良好的精密度及稳定性。
表 5 五种大麻酚的精密度测试结果（n=6）Table 5. Intraday and interday precisions of the method（n = 6）物质名称 RSD（%） 日内（n=6） 日间（n=6） CBDA 3.8 3.6 CBD 4.3 4.7 CBN 3.2 3.7 THC 4.0 4.2 THCA 2.0 2.5 2.4.3 加标回收率
本文对三个加标水平1.25、2.50、5.00 mg/kg的巧克力样品进行的加标回收实验结果见表6。由表6数据可得，CBDA的回收率在94.5%~103.2%之间，RSDr<3.2%，CBD的回收率在98.5%~109.0%之间，RSDr<2.0%；CBN的回收率在96.2%~102.7%之间，RSDr<4.9%；THC的回收率在91.8%~102.3%之间，RSDr<4.6%；THCA的回收率在92.0%~108.8%之间，RSDr<4.9%，五种大麻酚的加标回收率在91.8%~109.0%，其RSDr值在1.5%~4.9%。该结果表明，本研究建立的检测方法在不同加标水平下，具有较高的回收率和良好的精密度，能够满足巧克力样品中5 种大麻酚类物质检测的要求。
表 6 巧克力样品中五种大麻酚的回收率测定结果（n=6）Table 6. The recoveries of five cannabinoids at three spiked concentrations and relative standard deviations（RSD）in dark chocolate samples（n = 6）物质名称 加标水平
（1.25 mg/kg）加标水平
（2.50 mg/kg）加标水平
（5.00 mg/kg）回收率（%） RSDr（%） 回收率（%） RSDr（%） 回收率（%） RSDr（%） CBDA 95.0 3.2 94.5 1.7 103.2 1.9 CBD 105.3 2.0 98.5 1.2 109.0 1.7 CBN 102.7 1.5 96.2 3.9 96.7 4.9 THC 91.8 2.5 92.9 3.0 102.3 4.6 THCA 92.5 2.9 92.0 4.3 108.8 4.9 注：RSDr通过使用相同的仪器和操作人员并在短时间内重复，尽一切努力保持条件恒定时计算出的相对标准偏差。 2.4.4 实际样品检测
以本方法的提取方法和仪器条件对市售的两种黑巧克力进行五种大麻酚的测定，结果显示两种黑巧克力中均未检出五种大麻酚。
3. 结论
本文建立了一种基于高效液相色谱-串联质谱仪的同时检测黑巧克力中五种大麻酚类物质的分析方法，并对该方法进行了方法学验证。结果表明，该方法的日内和日间精密度的相对标准偏差RSDs值均<5%，说明该方法具有良好的精密度和稳定性；五种大麻酚物质在三个加标水平下的回收率为91.8%~109.0%，RSDs<5%，说明该方法具有较高的准确性。同时本方法具有简单、快速的特点，可以为大麻酚类物质的检测提供技术支持，又可以为国内大麻酚类物质的监测和合理使用提供依据。
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图 1 五种不同色谱柱对五种大麻酚分离TIC谱图的对比
注：（a）Zorbax SB-C18色谱柱;（b）Supersil ODS2 色谱柱;（c）Supersil ODS-B 色谱柱;（d）Cosmosil 5C18-MS-II 色谱柱;（e）Hplcone-3C18色谱柱。
Figure 1. The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids by five kinds of reversed-phase C18 columns
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图 2 不同洗脱程序下五种大麻酚分离的TIC对比图
注：（a）梯度分离；（b）等度分离。
Figure 2. The comparison of the TIC chromatograms of five cannabinoids based on different separations
表 1 常见大麻酚类物质基本信息
Table 1 Essential information of common cannabinoids
中文名 常见名 缩写 CAS 分子构型 大麻二酚 Cannabidiol CBD 13956-29-1 大麻二酚酸 Cannabidiolic acid CBDA 1244-58-2 次大麻二酚 Cannabidivarin CBDV 24274-48-4 大麻酚 Cannabinol CBN 521-35-7 Δ9-四氢大麻酚 Δ9-Tetrahydro-cannabinol THC 1972-08-3 四氢大麻酚酸 Tetrahydro-cannabinolic
acidTHCA 23978-85-0 
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表 2 五种大麻酚的质谱条件优化结果
Table 2 MRM parameters and MS condition for five cannabinoids
序号 物质名称 离子扫描模式 离子对（m/z） 碰撞能（eV） 套管透镜电压（V） 1. CBDA − 357.0>136.0 35 78 357.0>179.0 33 357.0>191.1 33 357.0>245.0* 32 2. CBD + 315.0>123.0 32 70 315.0>193.0* 32 315.0>195.1 31 3. CBN + 311.2>123.0 31 82 311.2>223.1* 33 311.2>293.2 32 4. THC + 315.0>123.0 32 70 315.0>193.0* 32 315.0>195.1 32 5. THCA − 357.0>136.0 35 78 357.0>179.0 33 357.0>191.1 33 357.0>245.0* 32 注：*为定量离子对。
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表 3 不同溶剂对五种大麻酚提取效率的影响
Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of five cannabinoids
物质名称 甲醇 乙腈 回收率（%） RSD（%） 回收率（%） RSD（%） CBDA 93.6 1.87 91.4 5.35 CBD 93.4 2.27 92.8 2.71 CBN 90.6 3.25 93.8 0.99 THC 91.1 1.18 92.8 0.27 THCA 95.8 4.01 96.3 3.64
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表 4 五种大麻酚的标准曲线线性范围、检出限及定量限
Table 4 Linear range, LOD and LOQ of five cannabinoids
物质名称 线性方程 线性范围（µg/mL） 相关系数（R2） LOD
（mg/kg）LOQ
（mg/kg）CBDA Y=487433+5430930X 0.05~5.0 0.9971 0.05 0.15 CBD Y=129709+2415660X 0.05~5.0 0.9988 0.05 0.15 CBN Y=122591+16333830X 0.05~5.0 0.9980 0.05 0.15 THC Y=181715+2818150X 0.05~5.0 0.9983 0.05 0.15 THCA Y=244586+4044510X 0.05~5.0 0.9973 0.05 0.15
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表 5 五种大麻酚的精密度测试结果（n=6）
Table 5 Intraday and interday precisions of the method（n = 6）
物质名称 RSD（%） 日内（n=6） 日间（n=6） CBDA 3.8 3.6 CBD 4.3 4.7 CBN 3.2 3.7 THC 4.0 4.2 THCA 2.0 2.5
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表 6 巧克力样品中五种大麻酚的回收率测定结果（n=6）
Table 6 The recoveries of five cannabinoids at three spiked concentrations and relative standard deviations（RSD）in dark chocolate samples（n = 6）
物质名称 加标水平
（1.25 mg/kg）加标水平
（2.50 mg/kg）加标水平
（5.00 mg/kg）回收率（%） RSDr（%） 回收率（%） RSDr（%） 回收率（%） RSDr（%） CBDA 95.0 3.2 94.5 1.7 103.2 1.9 CBD 105.3 2.0 98.5 1.2 109.0 1.7 CBN 102.7 1.5 96.2 3.9 96.7 4.9 THC 91.8 2.5 92.9 3.0 102.3 4.6 THCA 92.5 2.9 92.0 4.3 108.8 4.9 注：RSDr通过使用相同的仪器和操作人员并在短时间内重复，尽一切努力保持条件恒定时计算出的相对标准偏差。
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