Magnetic Imprinted Solid-Phase Extraction Combined with Imprinted Electrochemical Sensor for Rapid Detection of Erythromycin in Meat Products
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摘要: 本文旨在构建一种简便、快捷的肉制品中痕量红霉素磁性分子印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用的分析方法。采用新型表面印迹技术，制备出对ERY具有高选择性与灵敏性的红霉素磁性分子印迹聚合物（MMIP），再分别以MMIP作为固相萃取剂及电化学传感元构建印迹固相萃取-印迹电化学传感器（MMISPE-MMIP-sensor）联用技术快速检测系统。采用循环伏安（CV）及差分脉冲伏安（DPV）等方法对其电学性能进行探讨，通过红外光谱、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对其结构和形态进行表征。实验考察了缓冲溶液pH和孵化时间对印迹电极的影响。结果表明，最佳缓冲溶液pH为7.5，富集时间为10 min。在最优实验条件下，该印迹电极的响应电流△IR与ERY浓度的负对数（-logC[ERY]）在1.0×10−10~1.0×10−5 mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.991，最低检出限为1.0×10−10 mol/L。以AZI、STM、ROX三种结构类似物为干扰物，研究该印迹电极对ERY的吸附选择性。结果显示，该印迹电极只对红霉素分子具有特异识别作用而呈现最大响应值（0.72 mA）。重现性和稳定性实验结果显示该电极具有良好的重现性和稳定性。联用检测结果显示通过磁固相萃取和印迹电化学双预浓缩过程将样品中ERY富集浓度提高了9~12倍。Abstract: This paper aims to construct a simple and rapid method for analyzing trace amounts of erythromycin (ERY) in meat products by magnetic molecular imprinted solid-phase extraction combined with imprinted electrochemical sensors. Using ERY as the template molecule, dopamine (DA) as the functional monomer, and functionalized magnetic graphene-carbon nanotube composite as the modified carrier, erythromycin magnetic molecularly imprinted polymer (MMIP) with good selectivity and sensitivity to ERY was prepared by using a novel surface imprinting technology. Then, the magnetic imprinted solid-phase extraction combined with imprinted electrochemical sensor (MMISPE-MMIP-sensor) for rapid detection system was constructed by using MMIP as solid phase extraction agent and electrochemical sensor element, respectively. The methods including cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were used to discuss its electrical properties of the sensor with K3[Fe (CN)6] solution, and its structure and morphology were characterized by fourier infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM). The results showed that the surface of the carbon nanotube-graphene composite was covered with an imprinted polymer shell layer, and the shell layer have many nanoparticles on the surface. The effects of pH value of buffer solution and response time on the imprinted electrode were investigated. The results showed that the best buffer pH was 7.5, and the enrichment time was 10 min. Under this optimal conditions, the experimental conditions were optimized, the response current △IR and the negative logarithm (-logC[ERY]) of ERY concentration showed a good linear relationship in the range of 1.0×10−10~1.0×10−5 mol/L, the correlation coefficient was 0.991, and the lowest detection limit was 1.0×10−10 mol/L. The selectivity experiments of ERY on the imprinted electrode were studied by using three structural analogues AZI、STM and ROX as interferers. The results showed that the imprinted electrode only had a specific recognition effect on ERY and showed a maximum response value (0.72 mA); The results of reproducibility and stability experiments suggested that the electrode had good reproducibility and stability. The detection results suggested that the concentration of ERY enrichment in the samples were increased 9~12 times by the magnetic imprinted solid-phase extraction combined with imprinted electrochemical sensor preconcentration process.
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红霉素（Erythromycin, ERY）是一种具有高效抗菌性的大环内酯类抗生素，在人类临床医学和畜禽养殖业中被作为治疗药物广泛使用，而且还被违规添加到动物饲料中。由于红霉素在动物体内代谢时间较长，过量摄入会导致机体内的药物残留[1-2]。残留的红霉素会通过食物链进入人体，从而危害到人类健康，严重时可能会致癌、致畸和致突变[3-4]。因此，研究出一种快速、准确检测食品中红霉素含量的方法就变得尤为重要，目前红霉素的检测方法主要有色谱法[5]、紫外分光光度法[6]、电化学法[7]和毛细管电泳法[8]等。但这些检测方法通常存在价格昂贵、操作复杂、检测周期长等缺点。因此，建立灵敏度高的检测方法来监测食品中ERY的残留是非常必要的。
分子印迹技术（Molecular imprinting technique，MIT），是以目标分子为模板制备具有特异识别性能的一种聚合物分子识别仿生技术。分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）具有选择性高、灵敏度大、抗干扰能力强以及良好的稳定性等优点，在电化学传感器的制备上得到广泛应用[9-10]。MIPs对特定的目标分子具有专一性识别作用，对环境中的痕量（ng/g）有害成分也能够进行有效分离、富集。分子印迹电化学传感器能特异性识别目标分子，在食品安全检测、环境监测和药物缓释等诸多领域显示出良好的应用前景。例如，董燕婕等[11]采用电沉积法和共价吸附法将纳米金和壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯复合物修饰到电极表面，构建一种灵敏的电化学免疫传感器对动物源性食品中红霉素残留的测定，得到的线性范围为0.3~1000 mg/mL，检测限为0.15 ng/mL。何雪丽等[12]用链霉素为模板分子，吡咯为功能单体，构建链霉素分子印迹电化学传感器，该传感器的线性范围为5.0×10−8~8.0×10−5 mol/L。孙大明[13]研究了氧氟沙星分子印迹碳纳米管修饰电极快速测定水体中的氧氟沙星，该修饰电极线性范围为1.0×10−7~5.0×10−6 mol/L，检出限为1.0×10−8 mol/L。该方法虽然便捷、高效、灵敏度高的优点，但是线性范围窄，检出限较高成了研究工作的一个瓶颈。本文通过改进传统的印迹电化学方法，以磁性Fe3O4修饰石墨烯-碳纳米管增敏红霉素分子印迹电化学传感器，结合磁性印迹固相萃取技术，构建磁性印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用技术快速检测肉制品中痕量的ERY。该方法已被PRASAD等[14]和ZHANG等[15]进行了报道，具有广阔的发展前景和应用价值。
本研究选择以肉制品中残留的红霉素为模板分子，多巴胺（Dopamine，DA）为功能单体，采用组合印迹技术，以石墨烯-碳纳米管为基底材料、磁性Fe3O4纳米粒子为增敏基质，通过优化合成条件，研制出对红霉素具有高选择性、高吸附容量、印迹孔穴可塑和吸附速度快的印迹复合材料。将优选后的印迹复合材料分别作为固相萃取剂和电化学传感元，对肉制品中痕量的红霉素经过印迹萃取、富集，再结合印迹电化学传感器对富集液中的红霉素进行检测。成功构建了一种应用于肉制品中痕量红霉素的印迹分离富集及检测系统，从而简化肉制品中痕量复杂有害物质的分离、富集和分析检测工艺，实现从复杂环境中快速分离富集检测痕量红霉素。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
羧基化碳纳米管（MWCNTs-COOH） 深圳市纳米港有限公司；氧化石墨粉（GO） 上海碳素有公司；红霉素（ERY）、多巴胺（DA） 北京化学试剂公司；N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），偶氮二异丁腈（AIBN），二甲基丙烯酸乙二醇（EGDMA） 国药集团化学试剂有限公司；硝酸、浓硫酸 重庆川东化工有限公司；氯化铁，乙腈，乙酸，乙二醇，聚乙二醇，甲醇，乙醇，K3Fe[CN]6、K4Fe[CN]6 南京化学试剂股份有限公司；猪肉、羊肉和牛肉样品 购自当地超市；所有实验用水如无特别注明均为超纯水。
LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；CH660B电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；NicoletiS10傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR） 上海精密仪器仪表有限公司；Zeiss-SIGMA HD扫描电镜仪（SEM） 卡尔蔡司（上海）管理有限公司；JEM-1010透射电镜（TEM） JEOL日本电子公司； HS-DZG-6050 台式真空干燥箱 上海和晟仪器科技有限公司；PTFE高压反应釜 上海隆拓仪器设备有限公司；CSTHZ-82A超声振荡器 常州未来仪器制造有限公司；实验采用三电极体系：铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极（SCE），自制裸碳电极（CE）为工作电极。
1.2 实验方法
1.2.1 磁性分子印迹聚合物（MMIP/Gr-MWCNTs）的制备
1.2.1.1 氨基化氧化石墨烯的制备
参考文献[16-17]，称取0.5 g GO加入到300 mL的水溶液中，在超声功率为200 W，65 kHz下，超声分散1 h，然后加入1.5 g硼酸，3.0 g N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和5.0 g N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）于60 °C搅拌回流1 h后，再加入50 mL乙二胺回流5 h。反应完全后将产物过滤并分别用大量乙醇和水反复洗涤滤饼。最后将其放入60 °C真空干燥箱中恒温干燥10 h，获得氨基化氧化石墨烯（GO-NH2），备用。
1.2.1.2 磁性多壁碳纳米管制备
参照文献[18-19]，首先，称取1.5 g六水合三氯化铁溶解于30 mL乙二醇中搅拌形成橙色溶液，接着称取0.3 g羧基化碳纳米管加入到该溶液中，在超声功率为200 W，65 kHz的条件下超声分散1 h，再加入5.0 g醋酸钠和2.0 g聚乙二醇（2000）中继续搅拌35 min。然后将混合物密封置高压反应釜中，并升温至200 °C反应8 h，待反应完全后冷却至常温，分别用乙醇和超纯水洗涤，收集磁性羧基化碳纳米管（MWCNTs-COOH）复合材料，置于60 °C干燥箱中干燥10 h后获得磁性羧基化多壁碳纳米管。
1.2.1.3 磁性石墨烯-碳纳米管复合材料的制备
参考方法[20]，分别称取0.15 g磁性MWCNTs-COOH和0.2 g GO-NH2混合加入60 mL无水乙醇溶液在超声功率为200 W，65 kHz的条件下超声分散2 h。再加入2.0 g DCC和3.0 g NHS混合搅拌，然后将混合物置于60 °C高压釜中反应24 h。最后获得磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs），将产物移至真空烘箱中80 °C下干燥过夜备用。
1.2.1.4 磁性分子印迹聚合材料的制备
参照方法[21]，准确称取1.0 g ERY于锥形瓶中，加入0.5 g多巴胺、15 mL乙腈和 20 mL H2O在超声功率为200 W，65 kHz的条件下超声溶解，加入2.0 g Fe3O4@Gr-MWCNTs 纳米颗粒，超声混合。在混合液体中加入0.2 g EGDMA和0.3 g AIBN，在超声功率为200 W，65 kHz的条件下超声1 h分散，置于70 ℃反应釜中反应2 h，将聚合物用洗脱液进行洗涤去除模板分子ERY，聚合物放入真空烘箱中80 °C下干燥10 h，取出研磨200目过筛。即制得MMIP/Gr-MWCNTs。
磁性非印迹聚合物（MNIP/Gr-MWCNTs）的制备与上述过程相同，只是在制备过程中不加入模板分子ERY。
1.2.2 制备红霉素分子印迹传感器（MMIP/Gr-MWCNTs/CE）
自制碳电极：首先对裸碳电极进行预处理，将裸碳电极接上电线，在电极周围涂覆一层胶水，干燥固化后，再用砂纸和1.0、0.05 μm Al2O3对裸露碳电极表面进行抛光至镜面，然后用蒸馏水超声洗涤，干燥备用。
磁性石墨烯-碳纳米管印迹传感器（MMIP/Gr-MWCNTs/CE）的制备流程如图1所示，首先制备磁性碳纳米管-石墨烯复合物修饰电极Gr-MWCNTs/CE，步骤如下：将制备的电极浸入30 mL含有0.05 g磁性MWCNTs-Gr复合材料的PBS（pH7.5）溶液中，采用循环伏安法在扫描电位为0~0.8 V及扫描速度为0.05 V/s的条件下，循环扫描10圈，即获得Gr-MWCNTs/CE。然后制备ERY修饰电极MWCNTs-Gr/CE：分别称取0.15 g ERY和0.2 g多巴胺溶于10 mL乙醇溶液中配制成浓度为0.2 mol/L的ERY修饰液，采用电沉积技术在扫描电位为0~0.8 V及扫描速度为0.05 V/s，循环扫描10圈，获得MMIP/Gr-MWCNTs/NBD/CE。
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图 1 红霉素分子印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用检测示意图Figure 1. Schematic diagram of erythromycin molecularly imprinted solid phase extraction combined with imprinted electrochemical sensor for detection磁性石墨烯-碳纳米管非印迹传感器（MNIP/Gr-MWCNTs/CE）的制备，其制备过程跟磁性印迹聚合物MMIP/Gr-MWCNTs/CE相同，仅在聚合过程中不添加模板分子ERY。
1.2.3 肉制品样品预处理
肉类样品购自本地的超市，将肉类样品完全粉碎。准确称取粉碎的肉类样品10.0 g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入5 mL 1.5 mol/L NaOH溶液除去样品中的脂质，再加入20 mL乙腈溶液，涡旋10 min，于7000 r/min下离心取上清液，备用。
1.2.4 磁性固相萃取实验
首先称取50 mg磁性印迹聚合物MMIP/Gr-MWCNTs，将其分散在上述预处理后的肉制品样品提取液中，ERY加标浓度为1.0×10−5 mol/L，静置吸附30 min，吸附饱和后的磁性印迹聚合物在外部磁场作用下实现固液分离富集，将萃取液用高效液相色谱测定。接着收集磁性印迹聚合物，再用3.0 mL甲醇/乙酸（8:2，v/v）洗涤吸附在聚合物上的物质，然后收集洗脱液，将含有ERY的洗脱液用高效液相色谱进行测定。液相色谱检测条件，流动相：25 mmol/L磷酸二氢铵溶液（pH3.0）/乙腈（3:7，v/v）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：210 nm。
1.2.5 构建印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用检测系统
印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用检测方法，参照已报道的文献[14-15,22]，将制备好的磁性印记聚合物MMIP/Gr-MWCNTs分别作为固相萃取剂以及修饰电化学传感器，对肉制品样品中红霉素残留经过纯化、印迹萃取、富集，再结合印迹电化学传感器对富集液中红霉素进行检测。步骤如下：分别称取50 mg的MMIP/Gr-MWCNTs将其分散在25.0 mL ERY溶液中静止吸附30 min，然后通过外部磁场萃取分离，接着将印迹传感器孵入萃取液中10 min，然后通过外部磁场分离富集，富集液用3.0 mL甲醇/乙酸（8:2，v/v）洗涤。最后，以5.0×10−3 mol/L Fe（CN）63−/4−为探针，测定印迹传感器的DPV响应电流。
1.3 测试与表征
1.3.1 红外光谱表征
聚合物结构测定采用Nicolet iS10型红外光谱仪测试，精确称取磁性羧基碳纳米管（Fe3O4@MWCNTs-COOH）、磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）各2 mg，加入200 mg的KBr，混合研磨均匀后压片，然后置于恒温箱中平衡温度，红外光谱仪进行空气空白扫描，然后在分辨率为4 cm−1、扫描波段为400~4000 cm−1范围内扫描次数32次采集样品的红外谱图。
1.3.2 电镜仪测试
取适量样品均匀粘在扫描电镜观察台上，采用Zeiss-SIGMA HD型扫面电镜用InLens探测器，在加速电压为3 kV条件下进行观测。采用JEM-1010透射电镜，在点分辨率为0.3 nm，加速电压为20 kV，放大倍数70000倍以上的条件下进行观测。
1.3.3 电化学性能表征
以各修饰电极为工作电极，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极（SCE），在铁氰化钾/亚铁氰化钾Fe（CN）63−/4−缓冲溶液（5.0×10−3 mol/L，pH7.5）含有0.2 mol/L KCl的条件下测定电化学性能，每根电极重复测定三次。
1.4 数据处理
Origin 8.5、ChemDraw、Microsoft Windows、PPT用于数据分析和绘图。
2. 结果与分析
2.1 红外分析
采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对磁性羧基化碳纳米管（MWCNTs-COOH），磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）进行表征，结果如图2所示。图2a为磁性羧基碳纳米管特有的FT-IR光谱，其中，3300~3500 cm−1处为典型的羟基（O-H）伸缩振动峰，1618 cm−1和1382 cm−1处的吸收峰则是羰基（C=C）和羧基（C-OH）吸收峰[23]，此外在624 cm−1处的吸收峰为Fe-O官能团所致[24]，表明磁性羧基化碳纳米管含有羧基和羟基。图2b为磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）FT-IR谱图，在1701 cm−1处的吸收峰为C=O伸缩振特征吸收峰；此外，在1518 cm−1处的峰则对应于-NH-的弯曲振动特征吸收峰，1226 cm−1 处的吸收峰来自C-N键的伸缩振动，在1052 cm−1处和880~800 cm−1处的峰则是由于=C-H的弯曲振动引起，说明含有氨基[17]。此外，在648 cm−1处的峰则为酰胺基团的弯曲振动的特征峰，说明含有酰胺基团。综上，可以推断出该Fe3O4@Gr-MWCNTs复合材料成功制备。
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图 2 红外光谱表征图注：a：磁性羧基碳纳米管（Fe3O4@MWCNTs-COOH）；b：磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）。Figure 2. FT-IR spectra characterization2.2 电化学性能表征
本研究以多巴胺为功能单体，采用电聚合法，将修饰电极置于聚合液中以0.5 V/s扫速循环扫描10圈，如图3A所示。采用循环伏安法（CV）表征各修饰印迹电极的电化学性能。以5.0×10−3 mol/L Fe（CN）63−/4−为探针，扫描速度为0.05 V/s，电位为-0.3~0.8 V范围内循环扫描1圈，结果如图3B所示，裸电极（CE）呈现一对可逆的氧化还原峰如图3B（a），峰电流值为0.36 mA。当Fe3O4@Gr-MWCNTs复合材料修饰至裸表面，可见Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE的峰值电流1.33 mA较裸电极相比增大很多如图3B（b），这是由于Gr-MWCNTs复合材料具有高表面积和优异的导电性[25]。此外，磁性纳米粒子Fe3O4掺杂MWCNTs-Gr复合材料产生协同效应，Fe3O4提供了更多的电化学活性位点[26]。以多巴胺为功能单体，通过电聚合物法将ERY修饰至复合物表面，此时印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE峰电流降到最低1.05 mA，如图3B（c），说明模板分子ERY被特异吸附至印迹孔穴，阻碍了Fe（CN）63−/4−的扩散通道，导致印迹电极的峰电流减小。当模板分子被洗脱下来时峰电流为1.50 mA，峰电流明显增大图3B（d），这是由于洗脱后的印迹膜中形成大量的印迹孔穴，加速了Fe（CN）63−/4−电子转移速率。非印迹传感器MNIP/Gr-MWCNTs/CE在电极因为在电极表面没有形成印迹腔，但仍然存在响应峰电流1.25 mA，这是非特异吸附所致图3B（e）。
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图 3 各修饰电极的CV表征注：图（A）：电聚合过程图；图（B）：各修饰电极的循环伏安曲线图；a：裸电极；b：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE；c：洗脱红霉素分子之前印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE；d：洗脱红霉素分子后印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE；e：非印迹电极MNIP/Gr-MWCNTs/CE。Figure 3. Cyclic voltammograms characterization of each modified electrode2.3 形态分析
各修饰电极的电镜测试结果如图4所示，图4（a）为裸电极的SEM显微镜照片，观察到修饰前裸碳电极表面光滑。将聚合物Fe3O4@Gr-MWCNTs修饰至电极表面，结果如图4（b）所示，通过SEM和TEM显微仪观察到电极表面被聚合物覆盖，磁性Fe3O4纳米粒子包裹在复合物材料中，结合上述电学性能分析可知，此时该电极的峰电流达到1.33 mA，相比裸电极（0.36 mA）增大了0.97 mA，说明该聚合材料被成功修饰至电极上。图4（c）为磁性印迹聚合物MMIP/Gr-MWCNTs/CE的SEM照片，通过电聚合法将ERY分子修饰至电极表面，可见电极表面被紧密覆盖一层厚厚的膜，结合电化学结果被修饰后的印迹传感器峰电流降低至1.05 mA，说明非电化学活性的ERY被成功修饰至电极上。图4（d）为洗脱模板分子ERY后的印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE的SEM照片，可见电极表面被一层聚合物包裹，表面没有呈现印迹孔穴是因为印迹孔穴大多在印迹聚合物的内部，结合电学性能结果显示，洗脱后的印迹传感器峰电流达到最大值1.50 mA，表明模板分子ERY被成功洗脱。图4（e）为Fe3O4@Gr-MWCNTs 形成的TEM照片，由透射电镜图可见，Fe3O4纳米粒子粘附在碳纳米管和片层石墨烯上。
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图 4 不同修饰电极的电镜图注：（a）：裸电极（bare CE）；（b）：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极（Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE）；（c）：洗脱红霉素分子前印迹电极（MMIP/Gr-MWCNTs/CE of ERY before elution）；（d）：洗脱红霉素分子后印迹电极（MMIP/Gr-MWCNTs/CE of ERY after elution）的扫描电镜图；（e）：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极（Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE）的透射电镜图。Figure 4. Electron microscopic images of different modified electrodes2.4 pH和孵化时间对印迹传感器的影响
为了探讨缓冲液pH对印迹传感器的影响，先将印迹电极在1.0×10−5 mol/L ERY溶液中浸泡10 min，然后取出，再置于pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和含5.0×10−3 mol/L Fe（CN）63−/4−的PBS溶液中，采用DPV法检测MMIP/Gr-MWCNTs/CE在不同pH下的电流响应大小。从图5A可以看出，当pH从5.5~7.5时，响应电流逐渐增大；这是由于在印迹膜上存在与ERY进行特异性结合位点，有利于与ERY进行结合，因而MMIP/Gr-MWCNTs/CE电极响应电流较高。当pH从7.5到8.5时，响应电流逐渐减小。这是因为印迹膜上的印迹孔穴被ERY覆盖，导致Fe（CN）63−/4−很难扩散至电极表面。因此本研究选用pH为7.5的PBS溶液作为支持电解液。
将印迹电极分别浸泡在浓度为1.0×10−5 mol/L ERY乙醇溶液中，探讨电极孵化时间0~20 min对印迹传感器的DPV峰电流的影响，结果如图5B所示。在0~10 min内，MMIP/Gr-MWCNTs/CE的峰电流逐渐降低，表明模板分子ERY与印迹孔穴快速结合；当超过10 min时，峰电流趋于平衡，说明印迹孔穴吸附ERY达到饱和，因此该印迹电化学传感器最优孵化时间为10 min。
2.5 标准曲线建立
配制系列红霉素浓度范围为1.0×10−10~1.0×10−5 mol/L，将印迹电极置于含有0.2 mol/L （pH7.5）PBS溶液中，扫描速率为0.05 V/s，结果如图6A所示，印迹传感器MMIP/Gr-MWCNTs/CE的峰电流随着ERY浓度的增加而降低，这说明目标分子被逐渐吸附至印迹电极上，DPV的响应电流（ΔIR, ΔIR=IB–IP）与红霉素浓度的负对数（-logС[ERY]）呈线性关系。如图6B所示，该线性回归方程如下：
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图 6 不同浓度的红霉素标准溶液差分脉冲伏安图Figure 6. Differential pulse voltammetry of the different concentration erythromycin standard solutions(1) 式中：ΔIR和IP分别是MMIP/Gr-MWCNTs/CE印迹电极的响应电流和峰电流，IB是MMIP/Gr-MWCNTs/CE印迹电极的空白信号，C[ERY]为红霉素溶液浓度（mol/L)，该印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE的检出限为1.0×10−10 mol/L （S/N=3）。每一次检测以后，印迹电极应放在甲醇/乙酸溶液中除去模板分子。
2.6 联用检测结果分析
为了评估红霉素磁性分子印迹固相萃取-印迹电化学传感器（MMISPE-MMIP-sensor）联用系统的优越性，对肉制品样品中的ERY进行了分离富集，步骤参照第1.2.3-1.2.4节中的描述。分别用MMIP-sensor和MMISPE-MMIP-sensor对ERY样品溶液进行电化学检测，样品经磁性印迹固相萃取MMISPE处理前和处理后的峰值电流如图7A所示，由图可知，电化学传感器MMIP-sensor对肉制品样品溶液进行直接检测，得到的峰电流图7A中b低于空白电流图7A中a。然而，采用MMISPE预先进行富集（萃取效果见图7B），再与磁性印迹电化学传感器联用（MMISPE-MMIP-sensor）检测获得的峰电流值最低，如图7A中c所示，响应电流最大。结果表明，磁性印迹固相萃取-印迹电化学联用检测系统具有双预浓缩的优点，实现对复杂环境中痕量的ERY经过印迹萃取、分离富集快速检测。与单独的印迹电化学传感器MMIP-sensor检测相比，使用MMISPE-MMIP-sensor检测的峰值电流降低了0.22 mA左右。根据回归式（1）计算出磁性印迹固相萃取处理前后溶液中ERY浓度，双预浓缩过程将样品中ERY浓度提高了9~12倍。为了进一步验证MMISPE-MMIP-sensor联用检测系统的可靠性，利用MMIP-sensor与MMISPE联用（MMISPE-MMIP-sensor）检测肉制品中ERY，萃取液采用高效液相色谱法检测。
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图 7 磁性印迹电化学和磁性固相萃取与磁性印迹电化学传感器联用检测技术对3种肉制品中红霉素含量测定的应用注：图7A中a为空白检测峰电流，b为磁性印迹传感器检测峰电流，c印迹传感器-固相萃取联用检测峰电流。Figure 7. Application of magnetic imprinting electrochemistry and magnetic solid phase extraction combined with magnetic imprinting electrochemistry sensor for the determination of erythromycin content in three meat products图7B为肉制品样品中的ERY经MMISPE预处理后的色谱图。图7B（b）为MMIP/Gr-MWCNTs对样品溶液萃取后溶液的色谱图，可见图中ERY的峰面积小于图7B（a）中所示的ERY的标样，这是由于MMIP/Gr-MWCNTs对ERY具有较高的吸附能力。图7B（c）为ERY洗脱液的色谱图，洗脱液中ERY的峰面积大于标样的峰面积，进一步表明，MMISPE对ERY表现出更高的选择性和预富集能力。
2.7 选择性、稳定性和重现性
为了检验MMIP/Gr-MWCNTs/CE和MNIP/Gr-MWCNTs/CE的特异选择性，选择阿奇霉素（AZI）、链霉素（STM）和罗红霉素（ROX）三种与红霉素结构相似的类似物作为实验对象，如图8所示。本实验采用DPV法检验印迹电极和非印迹电极的响应电流，在优化实验条件下，将印迹电极和非印迹电极分别浸入1.0×10−5 mol/L红霉素、阿奇霉素、链霉素和罗红霉素溶液中，孵化10 min。结果如图9所示，印迹电极的响应电流分别为0.72、0.25、0.28和0.42 mA，相比于STM、AZI和ROX，红霉素印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE对ERY响应电流最大，这说明印迹电极对ERY具有特异识别性，主要是因为在合成MMIP/Gr-MWCNTs/CE时，印迹在聚合物中的ERY经洗脱后，在MMIP/Gr-MWCNTs/CE中留下了印迹孔穴与ERY的结构大小和形状一致，而其他分子空间结构不能与印迹孔穴完全匹配，结合少，所以响应电流小。非印迹传感器响应电流都比较小，是由于没有添加目标物质。
取5根制备好的印迹电极，将印迹电极浸入1.0×10−5 mol/L ERY溶液，孵化10 min，取出置于5.0×10−3 mol/L Fe（CN）63−/4− PBS （pH7.5）中采用DPV检测（结果如图9），计算相对标准偏差（RSD）为4.3%，这表明此印迹传感器具有良好的重现性。取制备好的印迹电极5根，在4 ℃下保存一个月后，置于1.0×10−5 mol/L ERY溶液中经过孵化、洗脱、检测，结果显示，平均响应电流减小了19.3%，这表明该印迹传感器良好的稳定性。
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图 9 印迹电极和非印迹电极对1.0×10−5 mol/L红霉素、阿奇霉素、链霉素和罗红霉素的DPV响应Figure 9. Current responses of selective recognition for the ERY and structural analogs with concentration of 1.0×10−5 mol/L on MMIP/Gr-MWCNTs/CE and MNIP/Gr-MWCNTs/CE electrochemical sensors by DPV response current3. 结论
本研究以MMIP/Gr-MWCNTs分别作为固相萃取剂和电化学传感元，构建了印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用检测方法。对肉制品中红霉素残留经过印迹萃取、富集，再结合印迹电化学传感器对富集液中红霉素进行检测。采用FTIR/SEM/TEM对其结构和形貌进行表征，并利用CV及DPV等手段对电学性能进行测试。结果显示，磁性印迹聚合物被成功制备，该印迹电极响应电流△IR与ERY浓度的负对数（-logC[ERY]）在1.0×10−10~1.0×10−5 mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.991，最低检出限为1.0×10−10 mol/L。联用检测结果显示通过磁固相萃取和印迹电化学双预浓缩过程将样品中ERY富集浓度提高了9~12倍。该印迹电化学传感器对红霉素具有良好的选择性稳定性，并成功用于实际样品中痕量ERY印迹分离富集与检测。
本研究成功构建了一种应用于肉制品中痕量红霉素的印迹分离富集及检测方法，从而简化肉制品中痕量复杂有害物质的分离、富集和分析检测工艺，实现了从复杂环境中快速分离富集检测痕量的红霉素，具有较好的实际应用前景。然而实验中发现工作电极受环境因素影响大，未来要提高工作电极的稳定性。以期为肉类等动物源性食品中ERY残留的日常监控提供一种稳定性高、选择性好的分析方法。
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图 1 红霉素分子印迹固相萃取-印迹电化学传感器联用检测示意图
Figure 1. Schematic diagram of erythromycin molecularly imprinted solid phase extraction combined with imprinted electrochemical sensor for detection
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图 2 红外光谱表征图
注：a：磁性羧基碳纳米管（Fe3O4@MWCNTs-COOH）；b：磁性石墨烯-碳纳米管复合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）。
Figure 2. FT-IR spectra characterization
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图 3 各修饰电极的CV表征
注：图（A）：电聚合过程图；图（B）：各修饰电极的循环伏安曲线图；a：裸电极；b：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE；c：洗脱红霉素分子之前印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE；d：洗脱红霉素分子后印迹电极MMIP/Gr-MWCNTs/CE；e：非印迹电极MNIP/Gr-MWCNTs/CE。
Figure 3. Cyclic voltammograms characterization of each modified electrode
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图 4 不同修饰电极的电镜图
注：（a）：裸电极（bare CE）；（b）：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极（Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE）；（c）：洗脱红霉素分子前印迹电极（MMIP/Gr-MWCNTs/CE of ERY before elution）；（d）：洗脱红霉素分子后印迹电极（MMIP/Gr-MWCNTs/CE of ERY after elution）的扫描电镜图；（e）：磁性石墨烯-碳纳米管复合物修饰电极（Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE）的透射电镜图。
Figure 4. Electron microscopic images of different modified electrodes
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图 6 不同浓度的红霉素标准溶液差分脉冲伏安图
Figure 6. Differential pulse voltammetry of the different concentration erythromycin standard solutions
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图 7 磁性印迹电化学和磁性固相萃取与磁性印迹电化学传感器联用检测技术对3种肉制品中红霉素含量测定的应用
注：图7A中a为空白检测峰电流，b为磁性印迹传感器检测峰电流，c印迹传感器-固相萃取联用检测峰电流。
Figure 7. Application of magnetic imprinting electrochemistry and magnetic solid phase extraction combined with magnetic imprinting electrochemistry sensor for the determination of erythromycin content in three meat products
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[1] 李培绪. 罗红霉素分子印迹吸附树脂的制备及吸附性能研究[J]. 食品工业科技,2017,38(19):74−78. [LI P X. Preparation and adsorption performance of roxithromycin molecular-imprinted resin[J]. Science and Technology of Food Industry,2017,38(19):74−78. [2] LI T H, LI X F, LIU H, et al. Preparation and characterization of molecularly imprinted polymers based on β-cyclodextrin-stabilized Pickering emulsion polymerization for selective recognition of erythromycin from river water and milk[J]. Journal of Separation Science,2020,43(18):3683−3690. doi: 10.1002/jssc.201901255
[3] 宋彬, 李进义, 荆涛, 等. 分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定猪肉中红霉素残留[J]. 色谱,2014,32(10):1111−1116. [SONG B, LI J Y, JING T, et al. Determination of erythromycin residues in pork by molecular-imprinted solid-phase extraction with high performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Chromatography,2014,32(10):1111−1116. doi: 10.3724/SP.J.1123.2014.06025 [4] 闫亮. 三维碳基磁性印迹萃取材料制备及其性能研究[D]. 吉首: 吉首大学, 2017. YAN L. Study on preparation and performance of three-dimensional carbon based magnetic imprinting extraction material[D]. Jishou: Jishou University, 2017.
[5] 郭雪琰, 付大友, 袁东, 等. 分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定水样中罗红霉素残留[J]. 分析试验室,2018,37(5):533−536. [GUO X Y, FU D Y, YUAN D, et al. Determination of roxithromycin residues in water samples by molecular imprinted solid phase extraction and high performance liquid chromatography[J]. Analytical Laboratory,2018,37(5):533−536. [6] 唐志民, 马新宾. 红霉素分子印迹材料的制备及吸附性能[J]. 齐鲁工业大学学报(自然科学版),2016,30(1):45−49. [TANG Z M, MA X B. Preparation and adsorption properties of erythromycin molecularly imprinted materials[J]. Journal of Qilu University of Technology(Natural Science Edition),2016,30(1):45−49. [7] 高敏君, 刘根起, 薛亚峰, 等. 红霉素分子印迹二维光子晶体水凝胶传感器的研究[J]. 分析化学,2017,45(5):727−733. [GAO M J, LIU G Q, XUE Y F, et al. Research on erythromycin molecularly imprinted two-dimensional photonic crystal hydrogel sensor[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry,2017,45(5):727−733. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160771 [8] 洪月琴. 大环内酯类抗生素残留的分子印迹固相萃取和毛细管电泳检测研究[D]. 镇江: 江苏大学, 2017. HONG Y Q. Study on determination of macrolides residues by molecular-imprinted solid-phase extraction and capillary electrophoresis[D]. Zhenjiang: Jiangsu University, 2017.
[9] LIANG A, HOU H, TANG S, et al. An advanced molecularly imprinted electrochemical sensor for the highly sensitive and selective detection and determination of human IgG[J]. Bioelectrochemistry,2021,137:107671−107683. doi: 10.1016/j.bioelechem.2020.107671
[10] KHULU S, NCUBE S, KGAME T, et al. Synthesis, characterization and application of a molecularly imprinted polymer as an adsorbent for solid-phase extraction of selected pharmaceuticals from water samples[J]. Polymer Bulletin,2021:1−21.
[11] 董燕婕, 赵善仓, 李增梅, 等. 电化学传感器测定猪肉中的红霉素残留含量[J]. 食品科技,2016,41(1):295−299. [DONG Y J, ZHAO S C, LI Z M, et al. Determination of erythromycin residue in pork by electrochemical sensor[J]. Food Science and Technology,2016,41(1):295−299. [12] 何雪丽, 李云倩, 宋雨莹, 等. 分子印迹电化学传感器检测链霉素[J]. 云南化工,2019,46(2):102−104. [HE X L, LI Y Q, SONG Y Y, et al. Molecular imprinted electrochemical sensor for detection of streptomycin[J]. Yunnan Chemical Industry,2019,46(2):102−104. doi: 10.3969/j.issn.1004-275X.2019.02.037 [13] 孙大明. 基于分子印迹碳纳米管修饰电极快速测定水中抗生素[J]. 水资源开发与管理,2017(5):32−36. [SUN D M. Rapid determination of antibiotics in water based on molecular-imprinted carbon nanotubes modified electrode[J]. Water Resources Development and Management,2017(5):32−36. [14] PRASAD B B, TIWARI M P, MADHURI R, et al. Enantioselective separation and electrochemical sensing of D- and L-tryptophan at ultratrace level using molecularly imprinted micro-solid phase extraction fiber coupled with complementary molecularly imprinted polymer-fiber sensor[J]. Journal of Chromatography B,2011,879:364−370. doi: 10.1016/j.jchromb.2010.12.023
[15] LONG F, WANG J, ZHANG Z, et al. Imprinted electrochemical sensor coupled with magnetic imprinted solid-phase extraction for selective and sensitive detection of tetrabromobisphenol S[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry,2016,777:58−66. doi: 10.1016/j.jelechem.2016.07.027
[16] FENG Y Y, HU, X P, ZHAO F Q, et al. Fe3O4/reduced graphene oxide-carbon nanotubes composite for the magnetic solid-phase extraction and HPLC determination of sulfonamides in milk[J]. Journal of Separation Science,2019,42(5):1058−1066.
[17] RAMANATHAN T, FISHER F T, RUOFF R S, et al. Amino-functionalized carbon nanotubes for binding to polymers and biological systems[J]. Chemistry of Materials,2005,17(6):1290−1295. doi: 10.1021/cm048357f
[18] XU H W, SUN J D, WANG H M, et al. Adsorption of aflatoxins and ochratoxins in edible vegetable oils with dopamine-coated magnetic multi-walled carbon nanotubes[J]. Food Chemistry,2021,365(15):130409−130419.
[19] JIA B, GAO L, SUN J. Self-assembly of magnetite beads along multiwalled carbon nanotubes via a simple hydrothermal process[J]. Carbon,2007,45:1476−1481. doi: 10.1016/j.carbon.2007.03.025
[20] ZHAO X Y, CHEN L G, LI B. Magnetic molecular imprinting polymers based on three-dimensional(3D) graphene-carbon nanotube hybrid composites for analysis of melamine in milk powder[J]. Food Chemistry,2018,255:226−234. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.02.078
[21] YAN L, YIN Y, LV P, et al. Synthesis and application of novel 3D magnetic chlorogenic acid imprinted polymers based on a Graphene-Carbon Nanotube composite[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(15):3091−3100. doi: 10.1021/acs.jafc.6b00518
[22] 吕运开, 张婧琦, 王晓虎, 等. 基于分子印迹聚合物微球的在线固相萃取-液相色谱联用技术测定牛奶中酰胺醇类药物残留[J]. 食品科学,2013,34(16):238−242. [LV Y K, ZHANG J Q, WANG X H, et al. Determination of amides and alcohols residues in milk by on-line solid-phase extraction and liquid chromatography based on molecular-imprinted polymer microspheres[J]. Food Science,2013,34(16):238−242. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201316048 [23] WANG S C, YANG J, ZHOU X Y, et al. Electrochemical properties of carbon nanotube/graphene oxide hybrid electrodes fabricated via layer-by-layer self-assembly[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry,2014,722:141−147.
[24] ZHU H Y, JIANG R, XIAO L, et al. A novel magnetically separable-Fe2O3/crosslinked chitosan adsorbent: Preparation, characterization and adsorption application for removal of hazardous azo dye[J]. Journal of Hazardous Materials,2010,179:251−257. doi: 10.1016/j.jhazmat.2010.02.087
[25] MA X, GAO F, DAI R, et al. Novel electrochemical sensing platform based on a molecularly imprinted polymer-decorated 3D-multi-walled carbon nanotube intercalated graphene aerogel for selective and sensitive detection of dopamine[J]. Analytical Methods,2020,12(14):1845−1851. doi: 10.1039/D0AY00033G
[26] AMATATONGCHAI M, SITANURAK J, SROYSEE W, et al. Highly sensitive and selective electrochemical paper-based device using a graphite screen-printed electrode modified with molecularly imprinted polymers coated Fe3O4@Au@SiO2 for serotonin determination[J]. Analytica Chimica Acta,2019,1077:255−265. doi: 10.1016/j.aca.2019.05.047
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