Isolation and Identification of a Vibrio alginolyticus Bacteriophage Va2001 and Its Application
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摘要: 为了开发水产品中溶藻弧菌的生物清除剂，以溶藻弧菌为宿主菌，从锦州市水产品市场、农贸市场、笔架山海域、超市及葫芦岛市某水产养殖场、鞍山市某养殖场等地方采集了约60份海产品及其养殖环境污水，应用双层平板法从中分离纯化获得1株烈性噬菌体，命名为Va2001。对Va2001的裂解谱、最佳感染复数（optimal multiplicity of infection）、一步生长曲线、温度和pH的稳定性等生物学特征进行了研究，并在牡蛎感染模型中测定了噬菌体对溶藻弧菌的清除效果。结果表明，该噬菌体Va2001属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科（Podoviridae），Va2001的裂解谱较窄，裂解率为32%，最佳感染复数为0.0001，潜伏期约为20 min，裂解期为100 min，平均裂解量为274 PFU/cell；在4~60 ℃、pH4~9范围内活性稳定。以牡蛎为感染模型的净化实验结果显示，噬菌体Va2001能够抑制养殖环境中溶藻弧菌的增长，降低牡蛎体内溶藻弧菌的含量；当养殖时间延长至72 h时，实验组中溶藻弧菌的数量降低约2个数量级。本研究的结果表明噬菌体Va2001具有良好的应用前景，可以作为海产品中溶藻弧菌的新型生物清除剂。Abstract: In order to develop the cleaning agent for Vibrio alginolyticus in aquatic products, about 60 pieces of seafood and sewage in their breeding environment were collected from aquatic product market and farmer’s market in Jinzhou City, Bijiashan sea area, supermarkets, an aquaculture farm in Huludao City, and a breeding farm in Anshan City, etc. A virulent phage strain, named Va2001, was obtained by isolating and purifying with double-layer plate method. The biological characteristics of Va2001, such as the lysis spectrum, optimal multiplicity of infection, one-step growth curve, temperature, and pH stability, were studied. In addition, the effect of bacteriophages clearing V. alginolyticus was determined in the oyster infection model. The results showed that the phage Va2001 belongs to the Podoviridae family of order Caudovirales. Va2001 had a narrow lysis spectrum, with a lysis rate of 32%. The optimal multiplicity of infection was 0.0001 and the incubation period was about 20 min. The lytic period was 100 min and the average burst size was 274 PFU/cell. The activity was stable in the range of 4~60 ℃ and pH4~9. The results of the cleaning test using oysters as the infection model showed that the bacteriophage Va2001 could inhibit the growth of V. alginolyticus in the breeding environment and reduce the content of V. alginolyticus in oysters. When the breeding time was extended to 72 hours, the number of V. alginolyticus in the experiment group decreased by about 2 lg. The results of this study indicate that the bacteriophage Va2001 has good application prospects and can be used as a new biological cleaning agent of V. alginolyticus in seafood.
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Keywords:
- V. alginolyticus /
- bacteriophage /
- biological characteristics /
- oysters /
- isolation /
- identification /
- sewage
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溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海洋环境中常见的一种嗜盐性革兰氏阴性菌，属于弧菌科弧菌属[1-2]。该菌主要分布在海域和河口地区，是水产动物的主要致病性弧菌之一。据报道，溶藻弧菌可感染虾、牡蛎、贝类等，给全球水产品养殖业造成重大的经济损失，这种现象已经阻碍了水产养殖业的稳定发展[3]。在水产领域传统的杀菌消毒的方式是使用抗菌药物和化学消毒剂，但长时间使用抗菌药物会使细菌产生耐药性，导致严重的病害，而且药物残留还会产生食品安全问题[4]。因此，寻找绿色、健康的生物防治剂抑制水产品养殖环境中的致病菌对保持水产品的健康及食品安全具有重要意义。
噬菌体（bacteriophage）是能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称[5]。噬菌体存在于多种生态环境中，种类繁多，数量巨大，达到1031（约为细菌数量的10倍）[6-7]。20世纪初，噬菌体由英国微生物学家Frederick Twort 和加拿大微生物学家Felixd’Herelle发现[8-9]。噬菌体在治疗动物、植物中的细菌性疾病、水产动物体内净化等方面有独特的应用优势[10-11]，尤其是自国家提倡“无抗养殖”以来，噬菌体作为抗菌药物的替代品重新引起人们的重视。噬菌体在污水方面的应用有，它可对水体环境进行消毒（如噬菌体PTCC1399和SBSWF27处理城市污水等），可作为传感器监测水体、用于治理活性污泥丝状膨胀等[12]。因此，噬菌体可用于细菌性疾病的防控。
本研究从锦州市水产品市场、超市、农贸市场、笔架山海域、葫芦岛市某水产养殖场、鞍山市某养殖场等采集的约60份海产品及其养殖环境污水中分离获得一株溶藻弧菌噬菌体Va2001，并且对其基本的生物学特征和应用进行了研究，为制备溶藻弧菌的新型清除剂提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
样品来源 锦州市水产市场、农贸市场、笔架山海域、超市及葫芦岛某水产养殖场、鞍山某养殖场的海产品及其养殖的污水；硫酸镁（MgSO4·7H2O） 天津博迪化工股份有限公司；氯化钠 美国MP公司；Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司；明胶 国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉、LB培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；2216E液体培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；Φ0.45 μm、Φ0.22 μm针孔过滤器 天津津腾实验设备有限公司。
5417R小型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；GI54DS自动压力蒸汽灭菌器 致微（厦门）仪器有限公司；SPX-250生化培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株培养
将−80 ℃保存的溶藻弧菌在含3.5% NaCl（以下方法中所描述的LB液体培养基均含3.5% NaCl，不再赘述）固体LB平板上划线接种，28 ℃培养10 h，挑取溶藻弧菌单菌落接种于10 mL的LB液体培养基中，28 ℃条件下130 r/min振荡培养10 h。
1.2.2 样品采集
采集60份海产品及其养殖环境污水，之后置于无菌采样袋中带回实验室，4 ℃保存备用。
1.2.3 噬菌体的分离纯化
参考Gencay等[13]的方法进行改进。将采集的海产品加入适量生理盐水匀浆后同污水样品都进行8000 r/min离心30 min，上清液经0.45 μm过滤器过滤，收集滤液。取40 mL滤液，加入10 mL LB液体培养基，同时加入10 mL对数生长期的溶藻弧菌，在28 ℃条件下130 r/min振荡培养10 h。次日，培养物4 ℃ 8000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm针头过滤器过滤，收集滤液。将滤液10倍梯度稀释至10−1~10−8，取500 μL各个样品的梯度稀释液和等体积的溶藻弧菌菌液混合，室温静置10 min。将上述混合液倾注双层平板，平板凝固后28 ℃倒置培养8 h。挑取单个噬菌斑置于1 mL SM缓冲液（1 g/L明胶，0.1 mol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4，1 mol/L Tri-HCl（pH7.5））的离心管中，4 ℃放置8 h。此步骤重复培养3~5次，使噬菌斑的形态一致，得到噬菌体液备用。
1.2.4 噬菌体的电镜观察
参考文献[14]，采用3%醋酸铀负染色法对噬菌体进行染色。首先对噬菌体增殖液进行纯化，分别取100 μL噬菌体液（效价1010 PFU/mL）、3%醋酸铀分别滴在盛有洁净封口膜的玻璃皿中。将铜网浸没在噬菌体液中，悬浮10 min，用滤纸缓慢吸干铜网上的水分。将铜网在3%的醋酸铀染料中负染5 min，用滤纸吸走多余的液体，室温下自然晾干。用JEM1200EX透射电子显微镜观察噬菌体的形态。
1.2.5 噬菌体裂解谱的测定
裂解谱测定采用双层平板的方法并加以改进[15]。取200 μL溶藻弧菌菌液与4 mL约50 ℃的2216E半固体培养基混合均匀，倾倒在下层固体琼脂培养基上。待上层半固体培养基凝固后，取100 μL噬菌体液均匀滴在平板上。待上层液体全部吸收后将双层平板倒置在28 ℃培养箱中培养8 h，观察平板上是否有噬菌斑产生。
1.2.6 噬菌体最佳感染复数（MOI）测定
感染复数是指噬菌体和细菌细胞数量的比值。将噬菌体和溶藻弧菌按照MOI=1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001、0.00000001比例分别加入10 mL的LB液体培养基中，在28 ℃条件下130 r/min振荡培养10 h。培养液8000 r/min离心10 min，经0.22 μm针孔过滤器过滤，参照Addy等[16]的方法用双层平板法测定其效价。每组实验进行三次重复。
1.2.7 噬菌体的一步生长曲线
一步生长曲线的测定的指标有三个分别是潜伏期（噬菌体吸附宿主细菌后释放子代噬菌体的时间）、爆发期（噬菌体开始释放至完全释放子代噬菌体的时间）、裂解量（宿主细菌被感染后子代噬菌体的释放的量）。参照Kabwe等[17]的方法，略加改进。具体步骤如下：取1 mL活化的溶藻弧菌菌液，按MOI=0.0001加入噬菌体Va2001，28 ℃培养箱中孵育10 min，8000 r/min离心10 min，弃上清，用2 mL LB液体培养基重悬沉淀，重复上述操作三次后，然后依次等量分装至离心管中，28 ℃条件下130 r/min振荡培养，此刻时间记为T0=0，每隔10 min取培养液200 μL，经0.22 μm针头过滤器过滤后用双层平板法测定其效价。使用Origin 9.0以感染时间为横坐标，噬菌体的效价为纵坐标，绘制一步生长曲线，裂解量的计算按照如下公式进行计算。
裂解量=裂解末期时噬菌体效价感染初期细菌的浓度 1.2.8 噬菌体的热稳定性
各取1 mL噬菌体液体（效价达1010 PFU/mL）于无菌的Ep管中，分别放入4、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80 ℃的水浴锅中，不同温度下孵育1 h后，立即进行冰浴，双层平板法测定噬菌体的效价。实验进行3次重复。
1.2.9 噬菌体pH的稳定性
用氢氧化钠和盐酸将10 mL LB液体培养基调pH1~13，分别加入1 mL噬菌体（效价达1010 PFU/mL），28 ℃条件下孵育1 h，双层平板法测定噬菌体效价。每组实验分别进行三次重复。
1.2.10 溶藻弧菌噬菌体Va2001的初步应用
参考Zhang和Ren[3,18]的方法略加修改。以牡蛎为感染模型测定噬菌体对溶藻弧菌的清除作用。购买海水精配制人工海水，海水精X的用量计算方法见下文公式。在装有人工海水的水箱中充气24 h以上进行除氯，之后用臭氧（3 L/min）对人工海水进行除菌。
X=(待配盐度−水体当前盐度)×(水体重量/1000)0.9 式中：X为海水晶的用量；水体当前的盐度及水体重量均为已知。
将购买的活体牡蛎暂养24 h后挑100只牡蛎分为5个处理组，每组20只：第1组，空白对照组，保持暂养状态，不添加人工污染细菌，不添加噬菌体；第2组，阳性对照组，人工污染细菌，不添加噬菌体，在人工海水中加入溶藻弧菌菌液至终浓度为1×106 CFU/mL，第3~5组感染相同浓度的细菌；第3组，人工污染细菌/噬菌体处理组，MOI=1；第4组：人工污染细菌/噬菌体处理组，MOI=0.1；第5组：人工污染细菌/噬菌体处理组，MOI=0.01。
在设置组别的过程中，因实际的应用过程中，噬菌体需要大量制备，最佳感染复数越低时，实验过程的浓度不易控制，为了避免数据有较大的误差，选择易于控制的MOI，且趋向于最佳感染复数值，研究不同的MOI对溶藻弧菌的控制的效果。每组设置三个平行组，每隔6 h观察不同的感染复数对牡蛎的保护效果，记录并统计牡蛎的成活率，计算如下。
Y(%)=(1−牡蛎累计死亡数量牡蛎的总体数量)×100 式中：Y为牡蛎的成活率；牡蛎的累计死亡数量通过实验过程中统计的数量进行计算。
每组每隔12 h取出三只牡蛎，将其去壳后，牡蛎肉的重量为（50±0.1）g，放置于无菌的均质袋中，拍打均质后，用平板计数法统计牡蛎中的溶藻弧菌的数量，拍打均匀后的牡蛎肉混合液经0.22 μm 滤膜过滤后，双层平板法测定噬菌体的效价。每组每隔12 h取2 mL的人工海水于无菌的Ep管中，用以上相同的方法测定溶藻弧菌和噬菌体的数量。每组实验设置三次重复。
1.3 数据处理
实验数据用SPSS 19.0统计学软件进行处理（利用Duncan检验，以P<0.05为差别有统计学意义），用Origin 9.0软件进行作图。
2. 结果与分析
2.1 噬菌体的分离纯化
如图1所示，以实验室保存的溶藻弧菌为宿主菌，从锦州市水产市场、农贸市场、笔架山海域、超市及葫芦岛某水产养殖场、鞍山某养殖场等地方采集的约60份海产品及其养殖环境污水中分离到一株溶藻弧菌噬菌体，命名为Va2001。挑取单个噬斑用双层平板法，纯化噬菌斑3~5次后，得到Va2001的噬菌斑圆形透明，形态大小基本保持一致，培养10 h后形成直径约0.32 mm的噬菌体斑。
2.2 噬菌体的电镜观察
噬菌体Va2001经过负染后，透射电镜下噬菌体的形态如图2。透射电镜下噬菌体的照片显示为有尾的，头部形态为六边形，直径约(46±5)nm，尾部不可收缩，尾长约(17±2)nm，尾宽约(10±1)nm。按照噬菌体的形态学分类，推断该噬菌体为有尾噬菌体目(Caudovirales)，自复制亚科中的短尾噬菌体科（Podoviridae）。
2.3 噬菌体裂解谱的测定
结合双层平板法测定噬菌体Va2001的裂解谱，结果如表1所示，所有受试菌株中，噬菌体对16株溶藻弧菌表现出阳性噬菌斑，对副溶血性弧菌、坎式弧菌、轮状弧菌等均表现为阴性。这表明，该株噬菌体仅能够裂解种内的不同分离源的溶藻弧菌，不能裂解其他分离源的弧菌。这表明本次实验分离的噬菌体Va2001对宿主菌有高度的专一性。
表 1 噬菌体Va2001的裂解谱Table 1. Analysis of bacteriophage Va2001 host rang菌株 分离源 裂解性 菌株 分离源 裂解性 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 胡瓜鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 大黄鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 + 溶藻弧菌（V .alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 + 溶藻弧菌（V.alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 蓝圆鲹 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V .alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 大黄鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鲍鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V.alginolyticus） 鰕虎鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 海螺 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 蓝圆鲹 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 海螺 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 − 坎式弧菌（V. campbelli） 银鲳鱼 − 副溶血弧菌（V. parahemolyticus） 蓝圆鲹 − 轮状弧菌（V. verticillata） 银鲳鱼 − 副溶血弧菌（V. parahemolyticus） 黄鲫鱼 − 注：+：表示裂解圈透明；−：表示裂解圈不透明。 2.4 噬菌体最佳感染复数（MOI）测定
用不同滴度的噬菌体Va2001感染宿主菌，用双层平板法测定培养后的噬菌体效价，最佳感染复数的结果如表2所示。该噬菌体Va2001的最佳MOI是0.0001。
表 2 噬菌体Va2001最佳感染复数的测定Table 2. Optimal multiplicity of infection determination of bacteriophages Va2001MOI 细菌数（CFU/mL） 噬菌体数（PFU/mL） 噬菌体效价（PFU/mL） 1 3.7×109 4.5×109 2.33×109 0.1 3.7×109 4.5×108 1.66×109 0.01 3.7×109 4.5×107 6.67×109 0.001 3.7×109 4.5×106 6.67×109 0.0001 3.7×109 4.5×105 3.67×1010 0.00001 3.7×109 4.5×104 2.33×1010 0.000001 3.7×109 4.5×103 1.13×1010 0.0000001 3.7×109 4.5×102 2.27×1010 0.00000001 3.7×109 4.5×101 2.52×1010 2.5 噬菌体的一步生长曲线
以最佳感染复数（MOI=0.0001）测定噬菌体Va2001的一步生长曲线，它的增殖规律大体呈现“S”型（图3）。噬菌体Va2001的潜伏期约是20 min，爆发期约是100 min，裂解量274 PFU/cell，一个裂解周期大约是120 min。
2.6 噬菌体的热稳定性
噬菌体Va2001的热稳定性显示（图4），噬菌体Va2001的活性在4~35 ℃较稳定，效价为1010 PFU/mL，在40~60 ℃时，噬菌体效价下降约1 lg PFU/mL；但噬菌体滴度达109 PFU/mL，70 ℃处理后，噬菌体仍有一定的活性，但80 ℃处理后噬菌体全部失活。
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图 4 温度对噬菌体Va2001效价的影响注：字母不同表示组间差异显著，P<0.05；图5同。Figure 4. Effect of temperature on bacteriophage Va2001 viability2.7 噬菌体的pH稳定性
噬菌体Va2001在不同pH条件下的稳定性（图5）表明，在4 ≤pH≤ 9范围，噬菌体Va2001效价在108 PFU/mL以上；在pH10和pH11条件下，噬菌体Va2001效价略有下降。但是，当pH≤2和pH≥13，噬菌体Va2001丧失活性。
2.8 噬菌体对牡蛎中溶藻弧菌的净化
应用牡蛎感染模型评价噬菌体Va2001对溶藻弧菌的清除效果，结果如下图所示。图6是不同的感染复数对牡蛎的保护效果，不同浓度的噬菌体对其保护效果不同。与对照组相比，随着养殖时间的延长，实验组（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中牡蛎的成活率不断降低；感染复数越高，牡蛎的死亡率减少的快，但长时间作用后，低浓度组更能显著(P<0.05)减少牡蛎的死亡。在第3 d时牡蛎的成活率均能接近85%；第4 d开始，成活率低于80%以下；在第10 d时，牡蛎的成活率在10%以下，说明在牡蛎在可控制的因素范围内，以牡蛎为感染模型应用于小型实验中是可行的。
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图 6 噬菌体Va2001不同的感染复数对牡蛎的保护效果Figure 6. Cumulative mortality of oysters at different V. alginolyticus bacteriophage Va2001 concentrations图7（a）是养殖环境中溶藻弧菌数量的变化，与单独添加溶藻弧菌的处理组相比，在人工污染细菌/噬菌体处理组中溶藻弧菌的数量降低。当时间延长至48 h，实验处理组（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中的溶藻弧菌的数量显著(P<0.05)降低；到72 h时，MOI=0.1和MOI=0.01组中溶藻弧菌的数量约降低1×102 CFU/mL。图7（b）中牡蛎体内溶藻弧菌数量的变化趋势与养殖环境中的一致。结果表明，高浓度的噬菌体Va2001处理组与低浓度组相比，前者比后者的溶藻弧菌的数量显著(P<0.05)降低，当延长培养时间至72 h，噬菌体Va2001低浓度处理组中溶藻弧菌的数量约下降2个数量级。说明噬菌体Va2001能够清除牡蛎体内的溶藻弧菌；与高浓度处理组相比，低浓度组所需的噬菌体用量较少，更经济。
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图 7 牡蛎感染模型中噬菌体Va2001应用后溶藻弧菌数量的变化注：a：牡蛎养殖环境中溶藻弧菌数量的变化；b：牡蛎体内溶藻弧菌数量的变化；大写字母不同表示组间差异显著，P<0.05；小写字母不同表示组内的差异显著，P<0.05。Figure 7. Number change of V. alginolyticus in oyster infection model by using bacteriophage Va2001图8（a）是养殖环境中噬菌体Va2001数量的变化，结果显示，随着培养时间的延长，噬菌体Va2001的数量上升。实验组（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中噬菌体数量明显升高；当作用72 h，噬菌体数量约提高1×102 PFU/mL。图8（b）是牡蛎体内噬菌体数量的变化，其变化趋势与环境中的基本保持一致。当培养时间延长，噬菌体的数量呈现上升的趋势，这是因为在养殖环境中宿主菌被噬菌体侵染，释放了子代噬菌体；在流体环境中能加速噬菌体的扩散的能力，若牡蛎在试验过程是活着的状态，每隔一定的时间，壳处于伸张闭合状态，另一方面，在取样期间，用蚝刀去壳时很吃力，这能够表明牡蛎是活着的状态，从而噬菌体能够清除牡蛎体内的溶藻弧菌，因此，以上现象说明噬菌体数量的升高是由于裂解养殖环境中溶藻弧菌的缘故，同时也证明在取样期间，牡蛎处于存活的状态。
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图 8 噬菌体Va2001应用在牡蛎感染模型中噬菌体数量的变化注：a：牡蛎养殖环境中噬菌体数量的变化；b：牡蛎体内噬菌体数量的变化；大写字母不同表示在组间差异显著，P<0.05；小写字母不同表示组内差异显著，P<0.05。Figure 8. Number change of bacteriophages in oyster infection model by using bacteriophage Va20013. 讨论与结论
噬菌体广泛分布在海水、污水、土壤中，是生态系统中最丰富的生物[6-7, 19-20]。因此，噬菌体可以从环境样本中分离得到，如溶藻弧菌噬菌体、副溶血性弧菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、柱状黄杆菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体等[18, 21-26]。
按照噬菌体形态学的分类，目前文献已经报道溶藻弧菌噬菌体的形态有多种，其中包括肌尾噬菌体科（Myoviridae）[14, 27]、短尾噬菌体科（Podoviridae）[28]，本研究中分离到的溶藻弧菌噬菌体Va2001属于有尾噬菌体目，短尾噬菌体科。据相关文献报道，以相同细菌为宿主，在不同地点分离的噬菌体的生物学特征可能是不同的[29-30]。本研究中的裂解谱结果显示，实验过程中分离到的噬菌体Va2001的裂解谱范围较窄，但其能对宿主菌形成透亮的噬菌体斑，说明它具有高度的特异性。但是可以通过其他的方式如基因编辑、鸡尾酒疗法等方式解决噬菌体的裂解谱窄的问题，本文中的噬菌体有待于用其他的方法拓宽裂解谱，来杀灭其他的细菌[6, 31-33]。本研究中利用噬菌体Va2001对宿主菌的特异性，为其在致病菌的检测方面奠定理论基础。
测定最佳感染复数可以指导噬菌体制剂等方面的研究。不同噬菌体的感染复数是不相同的。Kalatzis等[34]分离的溶藻弧菌噬菌体phiSt2和phiGrn1的最佳感染复数（MOI）分别是10、100；Lin等[1]报道的噬菌体ФA318最佳感染复数为0.1，本研究中的噬菌体最佳感染复数（MOI）是0.0001，相比较而言，本实验中的噬菌体Va2001有较强的裂解能力。因此在实际应用中所需的用量更少；同时，一步生长曲线测定结果显示潜伏期约是20 min，裂解期约是100 min，裂解量274 PFU/cell，说明噬菌体Va2001的裂解效率高，可降低制备噬菌体制剂的生产成本。
在测定噬菌体Va2001温度敏感性过程中，噬菌体的效价在70 ℃骤降，温度高于80 ℃，噬菌体失活，与Constantina等[35]研究的噬菌体VEN 的结果一致。这一结果说明温度过高，可能会使噬菌体的结构发生改变，从而造成噬菌体的裂解性能降低。噬菌体Va2001在pH4~9范围内，稳定性高；在pH12时，噬菌体有一定的活性；在pH≤2和pH≥13，噬菌体失活，表明在强酸或者强碱的环境中不能存活，这与Kim等[15]研究噬菌体pVa-21结果基本一致。本实验中分析噬菌体对温度和pH的耐受性，可以为噬菌体制剂的生产及应用提供指导作用。用噬菌体净化牡蛎体内的溶藻弧菌结果显示：不同的感染复数对牡蛎的保护效果是有差异性的，并且其在裂解人工海水中的溶藻弧菌的同时也能够清除牡蛎体内的溶藻弧菌，为海产品中溶藻弧菌的清除剂的开发提供依据。
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图 4 温度对噬菌体Va2001效价的影响
注：字母不同表示组间差异显著，P<0.05；图5同。
Figure 4. Effect of temperature on bacteriophage Va2001 viability
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图 6 噬菌体Va2001不同的感染复数对牡蛎的保护效果
Figure 6. Cumulative mortality of oysters at different V. alginolyticus bacteriophage Va2001 concentrations
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图 7 牡蛎感染模型中噬菌体Va2001应用后溶藻弧菌数量的变化
注：a：牡蛎养殖环境中溶藻弧菌数量的变化；b：牡蛎体内溶藻弧菌数量的变化；大写字母不同表示组间差异显著，P<0.05；小写字母不同表示组内的差异显著，P<0.05。
Figure 7. Number change of V. alginolyticus in oyster infection model by using bacteriophage Va2001
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图 8 噬菌体Va2001应用在牡蛎感染模型中噬菌体数量的变化
注：a：牡蛎养殖环境中噬菌体数量的变化；b：牡蛎体内噬菌体数量的变化；大写字母不同表示在组间差异显著，P<0.05；小写字母不同表示组内差异显著，P<0.05。
Figure 8. Number change of bacteriophages in oyster infection model by using bacteriophage Va2001
表 1 噬菌体Va2001的裂解谱
Table 1 Analysis of bacteriophage Va2001 host rang
菌株 分离源 裂解性 菌株 分离源 裂解性 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 胡瓜鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 大黄鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 + 溶藻弧菌（V .alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 + 溶藻弧菌（V.alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 蓝圆鲹 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V .alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 大黄鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鲍鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V.alginolyticus） 鰕虎鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 银鲳鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 海螺 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黑鳃梅童鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 黄鲫鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 蓝圆鲹 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 青柳蛤 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 四角蛤蜊 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 鰕虎鱼 + 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 海螺 − 溶藻弧菌（V. alginolyticus） 菲律宾蛤仔 − 坎式弧菌（V. campbelli） 银鲳鱼 − 副溶血弧菌（V. parahemolyticus） 蓝圆鲹 − 轮状弧菌（V. verticillata） 银鲳鱼 − 副溶血弧菌（V. parahemolyticus） 黄鲫鱼 − 注：+：表示裂解圈透明；−：表示裂解圈不透明。 
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表 2 噬菌体Va2001最佳感染复数的测定
Table 2 Optimal multiplicity of infection determination of bacteriophages Va2001
MOI 细菌数（CFU/mL） 噬菌体数（PFU/mL） 噬菌体效价（PFU/mL） 1 3.7×109 4.5×109 2.33×109 0.1 3.7×109 4.5×108 1.66×109 0.01 3.7×109 4.5×107 6.67×109 0.001 3.7×109 4.5×106 6.67×109 0.0001 3.7×109 4.5×105 3.67×1010 0.00001 3.7×109 4.5×104 2.33×1010 0.000001 3.7×109 4.5×103 1.13×1010 0.0000001 3.7×109 4.5×102 2.27×1010 0.00000001 3.7×109 4.5×101 2.52×1010
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