Research Progress of Nattokinase Quality and Safety Evaluation
-
摘要: 纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌在发酵纳豆过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓等生理功能。本文就纳豆激酶的溶栓功能及机制做了简要的总结，着重综述纳豆激酶活力测定方法等质量指标及其安全性评价研究进展，展望了纳豆激酶产品开发与质量安全研究方向，以期为纳豆及其制品（含纳豆激酶产品）标准化提供理论基础。Abstract: Nattokinase is a serine protease produced by Bacillus natto in the process of fermenting natto. It has physiological functions such as dissolving blood clots. This article briefly summarizes the thrombolytic function and mechanism of nattokinase, focusing on the research progress of nattokinase activity determination methods and other quality indicators and safety evaluation. The research direction of nattokinase product development and quality and safety is prospected, in order to provide a theoretical basis for the standardization of natto and its products (including nattokinase products).
-
Keywords:
- nattokinase /
- quality and safety /
- evaluation /
- thrombolytic function
-
纳豆（Natto）是大豆等豆类经纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵而成的一类豆制品[1]，在1980年，芝加哥大学医学院的日本研究员Hiroyuki Sumi通过实验发现，纳豆可以溶解人造纤维蛋白，1987年该团队从纳豆中提取到了一种溶解血栓的蛋白酶，并将这种新颖的纤溶酶命名为纳豆激酶（Nattokinase，NK）[2]。NK是一种丝氨酸蛋白酶，又称枯草杆菌蛋白酶NAT（EC 3.4.21.62）[3-4]，是典型的单链多肽酶，由275个氨基酸组成，分子量约为27 kDa，等电点在8.6左右[5]。
NK本质是一种蛋白质，主要是通过食用纳豆进入人体发挥作用，在人体内会被分解成多肽和氨基酸等小分子物质，使NK无法完整的进入血液中，存在其溶栓活性降低或完全丧失的弊端，并且部分氨基酸会在微生物分解作用下产生氨气及生物胺类物质从而使纳豆散发出臭味，在感官上很难被消费者接受[6]，为了降低或者消除传统发酵纳豆的氨臭味，经冷冻、提取、浓缩、干燥等程序后制得冻干粉，后经加工工艺的优化和口味的改良，出现复合粉、糖果、胶囊、片剂等产品形式。NK溶栓效果是评价NK质量的核心指标，NK除了溶解血栓的主要功能外，还可以预防骨质疏松[7]、降血压[8]、降血脂[9]、减脂助消化[10]、免疫调节[11]等。
目前对于产品中NK的质量评价主要体现在酶活力、酶稳定性及感官异味等，纳豆发酵产生NK、维生素K2等多种活性物质的同时，还会代谢产生生物胺类物质，大量摄入会影响人体的生命健康。目前我国的纳豆类产品及其形式多样，加之尚未建立NK的技术规范、质量标准和相应的检验方法，因此，本文通过简要综述NK功能与溶栓机理、产品质量与安全评价研究进展，旨在为开发NK保健食品或溶栓药品以及规范NK产品质量与安全评价方法提供理论依据。
1. 质量评价
自1987年发现NK以来，国内外的科研工作者在其酶活力测定方法及酶活特性方面进行了深入详尽的研究[12]，目前酶活力测定方法有琼脂糖-纤维蛋白平板法、纤维蛋白溶解法、合成基质反映法、四肽底物法、Na-对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯法（TAME）、酪蛋白溶解法、纤维蛋白块溶解时间法（CLT）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。NK溶栓功能作为评价其质量的核心指标，综合近年来NK研究成果表明，NK溶栓功能的重点研究在体内外溶栓效果及机理发掘等内容上。随着对NK特性、生理功能的深入研究，发现温度、pH、激活剂和抑制剂是评价NK稳定性的重要方面，并且NK的摄入会经过消化道吸收作用于人体，因此，考察不同NK产品的酶学特性是未来评价NK产品质量的一大研究方向。
1.1 酶活力测定方法
琼脂糖-纤维蛋白平板法是以纤维蛋白为底物测定NK活力的传统方法，也是最早应用于NK溶栓活力检测的方法之一，在国内实验室和企业研究中应用较为广泛，但该方法的准确度受实验室操作者主观及底物批次的影响较大，如果将量取平板溶解圈直径的工具及底物统一化，将会大大提高准确性[13]。2009年“纳豆之父”须见洋行博士提出了合成基质反应法，该方法以发色底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）和S-2444（pyro-Glu-Gly-Arg-pNA）作为测定NK活力的基质，在美国、欧盟等地区广泛应用，但该方法使用的基质是最适合纤溶酶和尿激酶反应的底物，不能完全反映NK的活力值。紫外分光光度法是在合成基质反应法的基础上发展起来的一种方法，被日本纳豆激酶协会称为纤维蛋白溶解法（http://j-nattokinase.org/），相比于四肽底物法、TAME法、酪蛋白溶解法等其他方法，该方法选择的纤维蛋白被认为是NK最合适的底物，解决了无法区分出真正的NK与其他相似酶的问题，测定NK活力准确性和精密度比其他方法要高，被认为是目前测定NK活力最合适的一种方法，日本最大的试剂制造厂商和光纯药（WAKO）已经采用该法来测定NK活力，并销售NK标准品。基于现有的国内外NK活力测定方法各有利弊的现状，亟需结合不同测定方法对市场产品检测的准确性差异进行优化改进，统一NK活力测定方法，更好的服务于NK类产品的质量评价。目前NK活力测定方法及检测活力的准确性总结如表1。
表 1 NK酶活力测定方法Table 1. NK enzyme activity determination method检测方法 酶活定义 酶活单位 优点 缺点 准确性 琼脂糖-纤维蛋白平板法 以溶圈面积大小的对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归曲线，得到尿激酶标准曲线，NK以尿激酶活性大小IU计。 IU 操作简单，直观方便，可同时进行多个样品测定。 溶解圈的面积容易受个人主观和孵育时间的影响，重现性不好。 准确度受操作者主观因素的影响。 紫外分光光度
法[14]在275 nm下，使吸光度每增加0.01时消耗的酶量。 FU 最合适的基质，适合定量试验，重复性好。 测定时间长。 不需要尿激酶等标准酶做标准曲线，准确性高。 合成基质反应法 根据NK的特性，选择其最合适的基质表征其活性，酶活力单位以IU计。 IU 结果稳定，测定时间短。 选择的基质对于纤溶酶和尿激酶而言是最合适的基质，不太适合NK活力的测定。 选择的基质作为底物，测定结果可以直接反应NK的酶活性，准确性较高。 四肽底物法 37 ℃条件下，1 min时间内1 mL反应体系中，水解四肽底物生成1 mmol对硝基苯胺的酶活为1 U。 U 耗时较短，线性较好，成本较低。 所测蛋白酶活力与其纤溶活性是否具有相关性待考察。 并非直接测定NK溶栓活性，而是测定酶内酰胺的水解活性，因此准确性较低。 TAME法 规定条件下，每分钟水解一个微克分子的样品量为1个TAME活力单位。 U 线性关系较好，可快速测定NK的酶活力[15]。 操作复杂，试剂易受环境的影响。 该方法是测定蛋白水解酶类活性的方法，测定结果不能完全反映NK活性。 酪蛋白溶解法 蛋白酶水解酪蛋白时产生酪氨酸, 在碱性条件下, 会与福林酚试剂反应显蓝色, 在680 nm处测定吸光值, 根据酪氨酸标准曲线计算样品酶活力。 CU 基质普遍应用，测定精准度较高。 无法辨别是单独NK酶活力还是混合酶活力。 准确性低，无法准确测定NK的具体活力。 CLT法 原理同琼脂糖-纤维蛋白平板法，根据气泡冒出到结束的时间来计算NK的活力大小。 IU 检测速度快，适合于粗酶的检测。 无法进行多个样品的测定，计时较严苛。 时间的控制容易受操作者的主观影响，准确度较低。 ELISA法 NK特异性单克隆抗体与带标记酶连接的多克隆抗体结合形成复合物，借助过氧化氢酶的反应来测定NK酶活力。 / 特异性和灵敏度都较高。 操作成本和要求高，实际应用会受限。 未查阅到该方法测定NK活力准确性的研究文献，准确性未知。 1.2 NK溶栓功能与机理
1.2.1 溶栓功能
NK在体内外溶栓实验中都表现出较强的纤溶活性，2008年，周伏忠等[16]提取纯化实验室的两种NK，分别作用于自然凝固的新鲜兔血，20 h后观察到两种NK的血块溶解率分别达到77.38%和85.08%。2003年，SUZUKI[17]采用光化学法致Sprague Dawley（SD）大鼠（五周大，雄性）内皮损伤形成壁血栓，纳豆提取物（NK）处理组血管壁血栓明显溶解，大部分血栓从血管壁表面脱落，说明NK对由内皮损伤引起的血栓具有良好的溶解效果。2019年，GUO等[18]采用肌肉注射舒泰的方式麻醉SD大鼠（n=8，雌雄各半），分离大鼠的右颈动脉，将浸渍过三氯化铁（FeCl3）的滤纸条覆盖于暴露的大脑中动脉诱导血栓形成，注射NK，使用激光多普勒流量计监测血流量，结果发现NK基本阻止了血栓的形成。2020年，WU等[19]选取6周大昆明小鼠（雄性，18~22 g）建立二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠肾小球血栓模型，LPS触发了氧化应激导致丙二醛（MDA）水平的升高，口服NK明显抑制了血清纤溶酶原激活物抑制剂Ⅰ（PAI-1）水平，打破了炎症、氧化应激和凝血之间的恶性循环，表明NK可以通过抗炎和抗氧化应激防止血栓形成的加速，为NK抗血栓机制提供了一种新型的见解。2009年，HSIA等[20]进行人体志愿者自身对照临床试验，将NK粗酶液冻干粉碎制成NK肠溶性胶囊（约200 mg/d），连续服用两个月可显著降低血清中几种凝血因子的水平，包括纤维蛋白原、Ⅶ因子和Ⅷ因子。
以上的体内外以及人体试验都证明了NK具有溶栓功能，和其它临床使用的抗血栓酶类物质如尿激酶（Urokinase，UK）、链激酶（Streptokinase，SK）等相比，它表现出更强的溶栓效果，纤溶能力约是纤溶酶的4倍[21]，且成本较低、来源方便、无副作用、不容易引发出血等，能更好的改善血液流动，因此在预防和治疗血栓类心脑血管疾病方面具有广阔的发展前景，有望开发成抗血栓类药物，投入临床应用[22-23]。
1.2.2 溶栓机理
目前临床上治疗血栓类疾病的酶类药物主要有UK、SK、组织纤溶酶原激活剂（Tissue plamnipen activator，t-PA）等，NK的溶栓作用类似于此类溶栓药物，目前比较成熟的NK溶栓机理有四种（图1）：a.NK的直接溶栓作用最早是FUJITA等[24]发现的，将纯化后的NK和交联纤维蛋白发生酶解反应，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）观察，在降解产物中发现了175、110、41、36、14.3 kDa等不同大小的片段，表明NK可以直接降解交联纤维蛋白。b.NK激活血管内皮细胞，诱导产生t-PA，t-PA促使纤溶酶原转化为纤溶酶，达到溶栓效果[25]。SUMI等[26]进行每天口服3次1.3 g NK肠溶胶囊人体志愿者试验，从试验对象的血液中提取并观察血浆球蛋白的变化，结果表明，从口服NK的第一天开始，血液中的纤维蛋白降解产物就会显著增加（P<0.05），还观察到t-PA增加，印证了t-PA可以促进血栓的溶解。c.NK刺激血管内皮细胞产生t-PA，将尿激酶原转化为UK，UK和t-PA一起激活纤溶酶原从而溶解血栓[27]。d.NK可以溶解PAI-Ⅰ，解除对t-PA的抑制作用，从而促进t-PA激活纤维蛋白酶溶解纤维蛋白，起到溶栓的效果。URANO等[28]将纯化后的NK作用于重组原核PAI-1（Recombinant Prokaryotic PAI-1，rpPAI-1），用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析其蛋白水解作用，采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）结合飞行时间（TOF）技术分别测定了完整和裂解形式的rpPAI-1的分子质量，结果表明rpPAI-1被裂解成更小的片段，NK使rpPAI-1在靠近其反应中心的位置裂解失活。
1.3 NK酶活特性研究
影响NK稳定性的因素有很多，主要有温度、pH、金属离子等。
1.3.1 温度
一般来讲，每种酶的酶活力都会有最适温度，温度降低酶活力会变小，温度过高会导致酶变性或失活，这主要和酶蛋白结构稳定性有关。李睿等[29]从本实验室发酵纳豆菌株中纯化得到NKII，结果显示47~ 60 ℃是NK的最适温度范围，55 ℃是发挥酶活的最适温度。DEVI等[30]表示45 ℃是本实验选取NK发挥最高酶活的温度，加热到70 ℃时，NK的强纤维蛋白溶解活性消失。肖美燕等[31]对NK反复冻融8次, 酶活力达到78%以上，在−20 ℃下保存7 d，酶活力基本不变。以上实验结果表明，虽然不同来源、不同蛋白结构NK的最适温度不一样，但基本可以定论NK在低温下稳定，在一定范围内温度越低酶活力损失越少，目前NK类产品的生产也主要是利用NK的这一特性，通过冷冻干燥的方式开发为冻干粉，进而加工成各种形式的产品，使其可以在人体温度37 ℃稳定发挥作用。
1.3.2 pH
pH会对酶活力产生影响，强酸强碱都会使酶变性或失活。中性和偏碱性环境下有利于NK酶活力的稳定，但在pH5.0以下极易失活。杨亚楠等[32]将纯化得到的NK和不同pH（3.0~11.0）的缓冲液混合，分别测定不同pH下的NK酶活力，结果表明该酶在此操作环境下的最适pH为7.0。王爱萍等[33]模拟人体胃液、肠液中的生理过程，对NK粗酶液和固体粉末2种状态的样品进行纤溶活性研究，结果表明，粗酶液和固体粉末在人工胃液（pH1.8）处理5 h左右后, 活性分别下降了72%和65%,再用人工肠液处理5 h, 活性分别下降了11%和9%，说明2种状态NK酶活力在人工胃液中大量损失，在人工肠液环境中较稳定。以上结果表明，NK在酸性和强碱性环境下不稳定，易失活，可以在中性或弱碱性条件下保存，保证NK酶活力的最大保留，为了避免NK类产品进入消化道后受到胃酸的破坏作用, 可以将其制成肠溶性的产品服用。
1.3.3 金属离子
不同金属离子对酶活力的影响存在差异，根据对酶活力产生的效果可以分为激活剂和抑制剂。Mg2+、Ca2+、Na+对于NK有明显的激活作用, Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+对NK的活性表现出不同程度的抑制，高浓度的K+对NK活性有抑制作用。MOU等[34]采用光谱法考察金属离子对NK活性和稳定性的影响，结果表明，化学计量比和高浓度的Cu2+、Co2+、Mn2+表现出不同程度的抑制作用，化学计量比的Tb3+和Ca2+对NK活性没有影响，而高浓度的Tb3+和Ca2+则表现出一定的促进作用。综合以上实验结果，Ca2+、Na+、Mg2+对NK酶活力有一定的促进作用，同时是人体需要最多的金属离子，可以将其加工成营养强化剂添加到NK类产品中，但要注意用量和非促进作用的金属离子摄入。
2. 安全评价
NK在保健食品领域具有广阔的发展前景，全面掌握NK的毒理安全性对于开发NK溶栓药物、保健产品至关重要。根据我国《保健食品安全性毒理学评价规范》，原料需进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验和28 d经口毒性试验等毒理学评价研究。除了产品安全性评价，其生产菌的安全性也应该得到重点关注，依据《以酶制剂等为原料的保健食品评审规定》（卫法监发〔2002〕100号），使用微生物发酵直接生产保健食品的，需要提供菌种的毒力试验报告和菌种的安全性评价报告。
2.1 NK的安全性
2.1.1 急性毒性研究
根据急性毒性实验要求，超过人类推荐100倍剂量无毒副反应说明可安全食用。WU等[35]选择六周大的昆明小鼠（18~22 g）进行NK急性毒性实验，每组20只，雌雄各半，以NK的最大浓度6000 Fu/mL和最大量40 mL/（kg·BW）灌胃，单日两次给药，对组织器官进行肉眼观察以及组织病理学评价，结果表明所有动物的体重都正常增加，未发现死亡或不良临床体征或急性出血并发症，未观察到NK治疗的毒性迹象，小鼠对NK的最大日耐受量高达480000 FU/kg。黄晓曼等[36]将酶活力为400 kU/kg的NK以最大浓度 10 kU/mL、最大给药容量 40 mL/（kg·BW）一次灌胃给药作用于NIH小鼠（18~22 g，雌雄各半），没有发现任何不良反应。尽管已有的动物实验研究证明在一定浓度范围内饲喂NK不会产生急性毒性作用，仍然需要进行大量体内外实验及人体流行病学调查来确保临床应用的安全性。
2.1.2 三项遗传毒性实验
2019年，WU等[35]进行了NK的细菌反向突变（Ames）试验、体外哺乳动物染色体畸变试验和体内哺乳动物微核试验三项遗传毒性试验。在Ames试验中，使用NK（EsseZymeTM）不同浓度（0、0.5、1.0、2.5和5.0 mg/板）对推荐菌株TA97、TA98、TA100和TA102处理后，NK对被测菌株回复突变菌落数均无显著影响，因此，NK对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株均无致突变性。以六周大的昆明小鼠（18~22 g，n＝10，雌雄各半）进行体内微核试验，连续四天以其最大每日耐受剂量240000 FU/（kg·BW）给药，NK处理组几乎未观察到任何微核。在体外染色体畸变试验中，在任何浓度的NK下，具有结构和数字染色体畸变的CHL细胞数量均不超过所检查细胞总数（每剂量水平200个细胞）的5%。本实验所选用的NK（EsseZymeTM）在三项遗传毒性试验中均未检测出遗传毒性。
2.1.3 28 d经口毒性研究
付玉生等[37]将规格为0.4 g/粒的NK胶囊设低、中、高三个剂量组, 即1.0、2.0、4.0 g/（kg·BW）掺入饲料中投喂SD大鼠，剂量分别为人体推荐量的25、50、100 倍，结果表明试验期间动物的活动、摄食、排便等一般状况未见明显异常，对大鼠体重、进食量和食物利用率、血液学检查结果、血清生化检验结果、对脏器重量和脏器系数等的影响和对照组相比，无统计学意义，各组动物剖检后肉眼观察各脏器颜色、形状、大小等均未见明显病变。FUJI等[38]选择SD大鼠进行28 d重复经口毒性研究，结果表明，大鼠的临床体征无明显变化，体重和食物消耗基本相等，进行肉眼检查并确定器官重量，准备选定的器官和组织以进行组织病理学研究，最终确定未观察到有害作用水平（No observed adverse effect level，NOAEL）为每天167 mg/（kg·BW）。
2.1.4 90 d经口毒性研究
BOZO等[38]通过管饲法分别以0、100、300和1000 mg/（kg·BW）的剂量施用于SD大鼠（每组12只，雌雄各半）90 d，每天进行临床体征的检查，最终未发现异常，这项研究的NOAEL为每天1000 mg/（kg·BW），这是目前NK 90 d经口毒性试验NOAEL的最高剂量。LAMPE等[39]使用NK产品NSK-SD（日本生物科学实验室有限公司，日本，20000 FU/g）对SD大鼠进行的28 d经口和90 d经口毒性研究，管饲剂量分别为167 mg/（kg·d）和1000 mg/（kg·d），临床及组织学病理研究都未观察到不良反应。
2.1.5 消化和吸收
NK作为一种具有溶栓功能的营养物质，其健康保健功效备受关注，虽然已有诸多动物[40]以及人体实验[41]证明口服NK后可以在肠胃道内检测到不同分子量的片段，但其在肠胃道内具体是以何形式被吸收来发挥治疗和预防作用鲜有研究。乔斌[42]通过在体外构建胃部与小肠模拟消化模型，复原人体的消化道环境，结果同王爱萍的实验结果一致，NK作为碱性蛋白质，对胃酸几乎没有耐受性，而在肠道环境下，NK可以很好的保持其自身空间结果；使用人结肠癌细胞Caco-2构建体外小肠上皮细胞吸收模型，结果表明，NK只有达到一定浓度才可以以完整的蛋白质分子穿越小肠上皮细胞进入血液循环，进一步证实了NK可以开发成口服性肠溶胶囊产品。目前关于NK代谢的研究甚少，关于NK在人体内的代谢途径及其机制研究是未来NK开发成保健食品或者溶栓药品的热点方向。
2.2 生产菌及其代谢产物的安全性
NK是由纳豆芽孢杆菌发酵豆类过程中产生的一类活性物质，纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌亚种，发酵菌株的安全性、有害代谢产物、杂菌污染等因素直接影响其安全性，因此明确生产菌及其代谢产物的安全性至关重要。
2.2.1 致病性
致病性也称为毒力，是指微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。YANAGISAWA等[43]将Meguro研究所（日本）提供的产品中提取到的纳豆枯草芽孢杆菌以50 mg/（kg·BW）和200 mg/（kg·BW）注射于雄性Wistar大鼠（8~9周龄，250~300 g），结果表明其身体健康指标没有明显变化（不摄入、摄入50 mg/kg、摄入200 mg/kg纳豆芽孢杆菌的优球蛋白溶解时间分别为(430±18)、(380±23)、(268±21) min）。HONG等[44]对新西兰白兔（3个月，雄性）灌胃1 mL纯化的纳豆菌孢子悬浮液（1×109/mL），进行30 d重复毒性试验，管饲Dunkin Harley豚鼠（五周大，雌雄各半）纳豆菌孢子悬浮液（1×1012/mL）进行14 d的毒性试验，结果发现在试验期间没有死亡报告，也没有观察到生命体征或体重有任何明显的变化，未观察到所选内脏器官和组织的变化，对照组和实验组血液学指标差异无统计学意义。
2.2.2 耐药性
抗生素滥用使得生物体内细菌产生耐药性甚至超级细菌，枯草芽孢杆菌可以抑制沙门氏菌、伤寒菌和痢疾菌等致病菌，在饲料行业作为益生菌取代抗生素发挥作用。但在食品行业，如果其存在可转移耐药基因，则有可能引起人体肠道细菌产生耐药性。曾祥燕等[45]从纳豆中筛选到四株纳豆芽孢杆菌，采用药敏纸片法测定其对阿散酸、土霉素、抗敌素等抗生素的耐受性，结果表明，四株菌株对这几类抗生素都表现出不敏感。董超等[46]在纳豆芽孢杆菌生长旺盛期加入常用的抗生素类药物，观察所引起的反应即耐药性的大小，结果表明，纳豆芽孢杆菌对酒石酸泰乐菌素、青霉素钾、阿莫西林最为敏感，建议在使用阿莫西林等药物时不要进食含纳豆菌的产品。因为抗生素种类繁多，目前纳豆芽孢杆菌耐药性效果多采用表型检测，缺乏耐药基因研究，纳豆菌与抗生素的相互作用效果以及食用过程中是否会产生耐药性基因的转移还需更深入细致的研究。
2.2.3 生物胺
近几年有关生物胺的研究表明，在纳豆发酵过程中会有生物胺类物质代谢产生，不但影响着产品的风味，还会带来潜在的食品安全隐患，过量摄入会引发头痛、恶心等一系列中毒症状[47]，因此控制和制定发酵纳豆摄入水平至关重要。高泽鑫等[48]分离到一株高产NK的枯草芽孢杆菌GULR06，利用高效液相色谱法对发酵过程中的生物胺进行检测，结果表明，尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亚精胺、组胺都能得到很好的分离，生物胺总量范围在26.47~72.97 mg/kg之间，在人体可接受范围内。目前未有纳豆芽孢杆菌生物胺的代谢对人体产生危害的报道，工业上可以通过菌种筛选或组合发酵[49]来控制纳豆过程中生物胺的代谢产生。
3. 结语与展望
老龄化已经成为我国一个极为严峻的社会问题，以心血管疾病为主的老年群体常见疾病大幅增加，据大数据统计，2016年中国有近1亿心血管病患者，1990~2016年，死于心脑血管病的人数从251万增至397万。虽然国家对于心血管疾病的投入力度加大、医疗技术进步，心血管疾病负担显著下降，但医疗福利覆盖不全面，地区治疗费用差异较高，老年病治愈率低，持续时间长。目前全球公众卫生安全面临着新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的威胁，现有研究表明，COVID-19病毒侵袭机体后，刺激血管内皮细胞致其损伤并诱导血管内弥漫性凝血，导致机体凝血功能紊乱[50-51]，老年人及有基础疾病者感染后病情较重。因此，提高NK酶活力和稳定性，开发以NK为核心的保健食品，扩大其临床和商业的应用符合《国民营养计划（2017-2030）》“老年人群营养支持行动”和《中国防治慢性病中长期规划（2017-2025年）》，将为改善老年人营养状况、提高老年人群的整体健康水平提供重要的政策支撑和保障。
我国NK的质量评价主要依赖于酶活力高低的测定，评价指标过于单一。为使产品适用人体服用环境，高效长久保存，研究其在不同温度、pH等影响因素下的稳定性，为完善NK质量评价方法提供理论基础，更好的服务于NK类保健食品及溶栓药品的开发。在我国纳豆制品类标准《DBS 44/013-2019 广东省食品安全地方标准 纳豆粉》和《SB/T 10528-2009 中华人民共和国国内贸易行业标准 纳豆》中，缺乏NK质量与安全评价的相关要求，因此需要尽快完善NK的统一行业标准，保证NK产品的质量安全，有利于我国以NK开发保健食品行业的健康长远发展。
-
表 1 NK酶活力测定方法
Table 1 NK enzyme activity determination method
检测方法 酶活定义 酶活单位 优点 缺点 准确性 琼脂糖-纤维蛋白平板法 以溶圈面积大小的对数为横坐标，浓度对数为纵坐标作回归曲线，得到尿激酶标准曲线，NK以尿激酶活性大小IU计。 IU 操作简单，直观方便，可同时进行多个样品测定。 溶解圈的面积容易受个人主观和孵育时间的影响，重现性不好。 准确度受操作者主观因素的影响。 紫外分光光度
法[14]在275 nm下，使吸光度每增加0.01时消耗的酶量。 FU 最合适的基质，适合定量试验，重复性好。 测定时间长。 不需要尿激酶等标准酶做标准曲线，准确性高。 合成基质反应法 根据NK的特性，选择其最合适的基质表征其活性，酶活力单位以IU计。 IU 结果稳定，测定时间短。 选择的基质对于纤溶酶和尿激酶而言是最合适的基质，不太适合NK活力的测定。 选择的基质作为底物，测定结果可以直接反应NK的酶活性，准确性较高。 四肽底物法 37 ℃条件下，1 min时间内1 mL反应体系中，水解四肽底物生成1 mmol对硝基苯胺的酶活为1 U。 U 耗时较短，线性较好，成本较低。 所测蛋白酶活力与其纤溶活性是否具有相关性待考察。 并非直接测定NK溶栓活性，而是测定酶内酰胺的水解活性，因此准确性较低。 TAME法 规定条件下，每分钟水解一个微克分子的样品量为1个TAME活力单位。 U 线性关系较好，可快速测定NK的酶活力[15]。 操作复杂，试剂易受环境的影响。 该方法是测定蛋白水解酶类活性的方法，测定结果不能完全反映NK活性。 酪蛋白溶解法 蛋白酶水解酪蛋白时产生酪氨酸, 在碱性条件下, 会与福林酚试剂反应显蓝色, 在680 nm处测定吸光值, 根据酪氨酸标准曲线计算样品酶活力。 CU 基质普遍应用，测定精准度较高。 无法辨别是单独NK酶活力还是混合酶活力。 准确性低，无法准确测定NK的具体活力。 CLT法 原理同琼脂糖-纤维蛋白平板法，根据气泡冒出到结束的时间来计算NK的活力大小。 IU 检测速度快，适合于粗酶的检测。 无法进行多个样品的测定，计时较严苛。 时间的控制容易受操作者的主观影响，准确度较低。 ELISA法 NK特异性单克隆抗体与带标记酶连接的多克隆抗体结合形成复合物，借助过氧化氢酶的反应来测定NK酶活力。 / 特异性和灵敏度都较高。 操作成本和要求高，实际应用会受限。 未查阅到该方法测定NK活力准确性的研究文献，准确性未知。 
下载: 导出CSV
-
[1] YOKO Y, CHEN P Y, ZHANG B, et al. Evaluation of seed chemical quality traits and sensory properties of natto soybean[J]. Food Chemistry,2014,153:186−192. doi: 10.1016/j.foodchem.2013.12.027
[2] SUMI H, HAMADA H, TSUSHIMA H, et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia,1987,43(10):1110−1111. doi: 10.1007/BF01956052
[3] THU N T A, KHUE N T M, HUY N D, et al. Characterizations and fibrinolytic activity of serine protease from Bacillus subtilis C10[J]. Current Pharm Biotechnology,2020,21(2):110−116. doi: 10.2174/1389201020666191002145415
[4] FATEMEH D, MANICA N, AYDIN B, et al. Nattokinase: Production and application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(22):9199−9206. doi: 10.1007/s00253-014-6135-3
[5] FUJITA, NOMURA, HONG, et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan[J]. Academic Press,1993,197(3):1340−1347.
[6] LIU Y, HE Y, HE B R, et al. The anti-osteoporostic effects of natto on bone mineral density in perimenopausal women[J]. Current Medicinal Chemistry, 2021, 28(25): 5191-5200.
[7] FUJITA M, OHNISHI K, TAKAOKA S, et al. Antihypertensive effects of continuous oral administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2011,34(11):1696−1701. doi: 10.1248/bpb.34.1696
[8] PARK K J, KANG J I, KIM T S, et al. The antithrombotic and fibrinolytic effect of natto in hypercholesterolemia rats[J]. Prev Nutr Food Sci,2012,17:78−82. doi: 10.3746/pnf.2012.17.1.078
[9] TANIGUCHI F A, YAMANAKA O H, NANIWA K Y, et al. Natto and viscous vegetables in a Japanese-style breakfast improved insulin sensitivity, lipid metabolism and oxidative stress in overweight subjects with impaired glucose tolerance[J]. British Journal of Nutrition,2013,107(8):1184−1191.
[10] 卓怡云, 吕婧, 刘颖, 等. 纳豆激酶对大鼠酒精性肝损伤的改善效果及免疫调节作用[J]. 食品科学,2019,40(7):156−162. [ZHUO Y Y, LÜ J, LIU Y, et al. Nattokinase alleviates alcoholic liver injury and modulates immune function in rats[J]. Food Science,2019,40(7):156−162. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20180326-340 [11] CAI D B, ZHU C J, CHEN S W. Microbial production of nattokinase: Current progress, challenge and prospect[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2017,33(5):84−84. doi: 10.1007/s11274-017-2253-2
[12] FA Y, ZHANG J L, ZHAO H J, et al. Progress in separation and purification of nattokinase and its enzyme activity determination[J]. Chinese Journal of Chromatography,2019,37(3):274. doi: 10.3724/SP.J.1123.2018.11010
[13] LIU Y C, CAI L Y, WANG X L, et al. Methods for assay of nattokinase activity and the dosage of dietary[J]. Hans Journal of Food and Nutrition Science,2020,9(2):132−136.
[14] 广东省卫生健康委员会. DBS 44/013-2019 广东省食品安全地方标准 纳豆粉[S]. 广东: 2019: 3−5. Guangdong Provincial Health Commission. DBS 44/013-2019 Guangdong provincial food safety standard natto powder[S]. Guangdong: 2019: 3−5.
[15] 敖宇涛, 王冬雪, 许灵善, 等. 纳豆冻干粉中纳豆激酶的活性测定[J]. 食品与发酵科技,2016,52(6):96−98. [AO Y T, WANG D X, XU L S, et al. Detection of nattokinase activity in a crude extract of natto freeze-dried powder[J]. Food and Fermentation Technology,2016,52(6):96−98. [16] 周伏忠, 贾蕴莉, 陈国参, 等. 纳豆激酶体溶栓效果的初步观外察[J]. 食品科技,2008(6):249−253. [ZHOU F Z, JIA Y L, CHEN G C, et al. Preliminary observation on the thrombolytic effect of nattokinase[J]. Food Technology,2008(6):249−253. doi: 10.3969/j.issn.1005-9989.2008.06.077 [17] SUZUKI Y, KONDO K, MATSUMOTO Y. Dietary supplementation of fermented soybean, natto, suppresses intimal thickening and modulates the lysis of mural thrombi after endothelial injury in rat femoral artery[J]. Life Sciences,2003,73(10):1289−1298. doi: 10.1016/S0024-3205(03)00426-0
[18] GUO H Y, BAN Y H, CHA Y, et al. Comparative anti-thrombotic activity and haemorrhagic adverse effect of nattokinase and tissue-type plasminogen activator[J]. Food Science and Biotechnology,2019,28(5):1535−1542. doi: 10.1007/s10068-019-00580-1
[19] WU H, WANG Y, ZHANG Y P, et al. Breaking the vicious loop between inflammation, oxidative stress and coagulation, a novel anti-thrombus insight of nattokinase by inhibiting LPS-induced inflammation and oxidative stress[J]. Redox Biology,2020:32.
[20] HSIA C H, HSIA M C, LIN J S, et al. Nattokinase decreases plasma levels of fibrinogen, factor VII, and factor VIII in human subjects[J]. Nutrition Research,2009,29(3):190−196. doi: 10.1016/j.nutres.2009.01.009
[21] 刘玉猛, 刘英华. 纳豆激酶在血管性疾病防治中的研究进展[J]. 中国食物与营养,2020,26(9):1−4. [LIU Y M, LIU Y H. Research progress on prevention and treatment on vascular diseases of nattokinase[J]. Food and Nutrition in China,2020,26(9):1−4. [22] NAGATA C, WADA K, TAMURA T, et al. Dietary soy and natto intake and cardiovascular disease mortality in Japanese adults: The Takayama study[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,2017,105(2):426−431. doi: 10.3945/ajcn.116.137281
[23] WENG Y Q, YAO J, SPARKS S, et al. Nattokinase: An oral antithrombotic agent for the prevention of cardiovascular disease[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(3):523.
[24] FUJITA M, ITO Y, HONG K, et al. Characterization of nattokinase-degraded products from human fibrinogen or cross-linked fibrin[J]. Fibrinolysis and Proteolysis,1995,9(3):157−164. doi: 10.1016/S0268-9499(95)80005-0
[25] OHSUGI T, SUMIDA E, SUMI H. Effect of a novel substance from natto on tissue-type plasminogen activator (t-PA) release in perfused rat hindlegs[J]. The Open Food Science Journal,2013,7:1−5.
[26] SUMI H, HAMADA H, NAKANISHI K, et al. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase[J]. Acta Haematologica,1990,84(3):139−143. doi: 10.1159/000205051
[27] YATAGAI C, MARUYAMA M, KAWAHARA T, et al. Nattokinase promoted tissue plasminogen activator release from human cells[J]. Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis,2008,36(5):227−232.
[28] URANO T, IHARA H, UMEMURA K. The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis Cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1[J]. Journal of Biological Chemistry,2001,276(27):24690−24696. doi: 10.1074/jbc.M101751200
[29] 李睿, 阮文辉, 熊晓辉. 纳豆激酶的酶学性质研究[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版),2015,36(2):106−110. [LI R, RUAN W H, XIONG X H. Study on the characteristics of nattokinase[J]. Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition),2015,36(2):106−110. [30] DEVI C S, MOHANASRINIVASAN V, SHARMA P, et al. Production, purification and stability studies on nattokinase: A therapeutic protein extracted from mutant pseudomonas aeruginosa, CMSS isolated from bovine milk[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics,2016,22(2):263−269. doi: 10.1007/s10989-015-9505-5
[31] 肖美燕, 徐尔尼, 陈武根. 纳豆激酶的稳定性研究[J]. 山西食品工业,2005(2):2−4. [XIAO M Y, XU ER N, CHEN W G. Study on the stability of nattokinase[J]. Shanxi Food Industry,2005(2):2−4. [32] 杨亚楠, 陈慧洁, 余河水, 等. 纳豆激酶稳定性研究[J]. 辽宁中医药大学学报,2018,20(11):41−44. [YANG Y N, CHEN H J, YU H S, et al. Study on the stability of nattokinase[J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2018,20(11):41−44. [33] 王爱萍, 毛双法, 林燕飞, 等. 人工胃肠液对纳豆激酶纤溶活性影响研究[J]. 食品安全质量检测学报,2018,9(18):4800−4803. [WANG A P, MAO S F, LIN Y F, et al. Effect of artificial gastrointestinal fluid on the fibrinolytic activity of nattokinase[J]. Journal of Food Safety and Quality,2018,9(18):4800−4803. doi: 10.3969/j.issn.2095-0381.2018.18.006 [34] MOU X C, YANG R J, ZHANG W L, et al. Effect of Tb(Ⅲ) on activity and stability of nattokinase[J]. Journal of Rare Earths,2017,35(5):510−517. doi: 10.1016/S1002-0721(17)60941-4
[35] WU H, WANG H, XU F, et al. Acute toxicity and genotoxicity evaluations of nattokinase, a promising agent for cardiovascular diseases prevention[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology,2019,103:205−209. doi: 10.1016/j.yrtph.2019.02.006
[36] 黄晓曼, 杨鹊, 邱志健, 等. 纳豆激酶的安全性试验[J]. 中国食品添加剂,2008(2):109−112. [HUANG X M, YANG Q, QIU Z J, et al. Toxicological assessment of nattokinase[J]. China Food Additives,2008(2):109−112. doi: 10.3969/j.issn.1006-2513.2008.02.026 [37] 付玉生, 李永利, 张焱, 等. 纳豆激酶胶囊毒理学安全性评价[J]. 实用预防医学,2012,19(11):1714−1716. [FU Y S, LI Y L, ZHANG Y, et al. Toxicological safety assessment on safety of nattokinase capsule[J]. Practical Preventive Medicine,2012,19(11):1714−1716. doi: 10.3969/j.issn.1006-3110.2012.11.044 [38] NONE. Safety of fermented soybean extract NSK-SD® as a novel food pursuant to Regulation(EC)No 258/97[J]. EFSA Journal, 2016, 14(7).
[39] LAMPE B J, ENGLISH J C. Toxicological assessment of nattokinase derived from Bacillus subtilis var. natto[J]. Food and Chemical Toxicology,2016,88:87−89. doi: 10.1016/j.fct.2015.12.025
[40] FUJITA M, HONG K, ITO Y, et al. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,1995,18(9):1194−1196. doi: 10.1248/bpb.18.1194
[41] ERO M P, NG C M, MIHAILOVSKI T, et al. A pilot study on the serum pharmacokinetics of nattokinase in humans following a single, oral, daily dose[J]. Alternative Therapies in Health and Medicine,2013,19(3):16−19.
[42] 乔斌. 纳豆激酶发酵优化及体外模拟胃肠消化吸收的研究[D]. 济南: 山东大学, 2020. QIAO B. Reseach on optimization of nattokinase fermentation and in vitro simulation of gastrointestinal digestion and absorption[D]. Ji Nan: Shan Dong University, 2020.
[43] SUMI H, YANAGISAWA Y, YATAGAI C, et al. Natto bacillus as an oral fibrinolytic agent: Nattokinase activity and the ingestion effect of Bacillus subtilis natto[J]. Food Science and Technology Research,2004,10(1):17−20. doi: 10.3136/fstr.10.17
[44] HONG H A, HUANG J M, KHANEJA R, et al. The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics[J]. Journal of Applied Microbiology,2008,105(2):510−520. doi: 10.1111/j.1365-2672.2008.03773.x
[45] 曾祥燕, 赵良忠. 纳豆芽孢益生杆菌的筛选鉴定及耐受性、抑菌能力的研究[J]. 食品工业科技,2015,36(1):160−165. [ZENG X Y, ZHAO L Z. Study on screening and identification, endured abilities and restraining the nocuous abilities of bacillus subtili natto[J]. Science and Technology of Food Industry,2015,36(1):160−165. [46] 董超, 张丽萍, 尹淑丽, 等. 纳豆芽孢杆菌对饲料中常用药物的敏感性和抗药性研究[J]. 黑龙江畜牧兽医,2008(11):45−46. [DONG C, ZHANG L P, YIN S L, et al. Study on the sensitivity and resistance of Bacillus natto to commonly used drugs in feed[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2008(11):45−46. doi: 10.3969/j.issn.1004-7034.2008.11.024 [47] EMIKO O, KOEI H. Polyamine profiles during natto fermentation[J]. Japanese Journal of Nutrition and Dietetics,2010,64(3):185−188.
[48] 高泽鑫, 何腊平, 刘亚兵, 等. 高产纳豆激酶菌株的分离与发酵纳豆过程中生物胺的变化[J]. 食品科学,2018,39(14):185−191. [GAO Z X, HE L P, LIU Y B, et al. Screening of a high-yield nattokinase-producing strain and changes of biogenic amines during natto fermentation[J]. Food Science,2018,39(14):185−191. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201814028 [49] LAN G Q, LI C Q, HE L P, et al. Effects of different strains and fermentation method on nattokinase activity, biogenic amines, and sensory characteristics of natto[J]. Journal of Food Science and Technology,2020,57:4414−4423.
[50] GOSHUA G, PINE A B, MEIZLISH M L, et al. Endotheliopathy in COVID-19-associated coagulopathy: Evidence from a single-centre, cross-sectional study[J]. Lancet Haematol,2020,7(8):575−582. doi: 10.1016/S2352-3026(20)30216-7
[51] REN B, YAN F, DENG Z, et al. Extremely high incidence of lower extremity deep venous thrombosis in 48 patients with severe COVID-19 in Wuhan[J]. Circulation,2020,142(2):181−183. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.047407
下载:
计量
- 文章访问数: 331
- HTML全文浏览量: 252
- PDF下载量: 30
